ИНВЕСТИЦИОННЫЙ ПОРТАЛ ВОЛГОГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ

Обратите внимание! Дополнительно докупают керамзит для дренажа.

Как посадить хойю

Слишком просторная тара для лианы не годится. Там она станет наращивать зелень, но цвести не будет, даже если усиленно за ней ухаживать. Не имеет принципиального значения материал горшка. Это может быть пластик, керамика, стекло, главное, он должен быть непрозрачным. В глиняных емкостях влага не задерживается, поэтому цветок в ней придется поливать чаще.

Перед пересадкой хойю хорошо поливают, чтобы земляной ком с корнями было как можно легче извлечь и не повредить. Лучше всего перевалить растение в новую тару, досыпав свежей почвы. Всю процедуру проделывают не спеша, чтобы не сломать побеги и корешки. Обязательно устанавливают опору, по которой лиана будет пускать новые побеги.

Лиане необходимо обеспечить опору

Как вырастить хойю из семян в домашних условиях

Не самый популярный способ размножения — семенами. Требуются только свежие зернышки (не старше 1 года), у них коричневая оболочка. Их слегка подсушивают, а после высаживают в почву, обладающую высоким показателем гигроскопичности. Для этого в нее даже добавляют натуральные волокна (лен, войлок, мешковину).

Скорость прорастания — 7 дней. Первым на поверхности посадочной емкости появляется коротенький зеленый стебелек, на котором после появляются листочки. В это время следует строго соблюдать следующие правила:

• почва должна быть всегда чуть влажная;
• переувлажнение опасно, так как может спровоцировать загнивание ростков;
• регулярно субстрат опрыскивают фунгицидами для предотвращения образования плесени;
• если горшки стоят на свежем воздухе, то для них наибольшую угрозу представляют улитки и слизни, поэтому стоит выбрать место повыше над землей.

Важно! В первые полгода никакие удобрения не вносят, чтобы не обжечь нежные корешки.

Хорошо подходят для проращивания семян хойи шарики сфагнума, которые заворачивают в нейлоновую сетку. Влажный мох не деформируется. Через сеточку семена прекрасно проклевываются. На постоянное место ростки пересаживают вместе со сфагнумом. Это самая щадящая методика для тонких и хрупких корешков.

Посадка семян хойи в горшок

В емкости, куда посеяли семена, ростки оставляют на 3 месяца. Этого времени будет достаточно, чтобы молодые лианы набрались сил, окрепли, нарастили несколько листиков. Не стоит удивляться, что все растения будут сильно отличаться друг от друга размерами. Это вполне нормально. Оставляют из них только самые крепкие и сильные. Слабые ростки стоит выбросить, так как получить из них крепкую лиану маловероятно, а сил и времени они потребуют немало.

Ростки хойи из семян

Иногда внимательный осмотр ростков выявляет, что среди них имеются мутировавшие экземпляры. Это тоже не редкость. Есть небольшая вероятность, что из-за скрещивания произошло формирование нового сорта. Поэтому всем росткам стоит дать шанс на жизнь до тех пор, пока они в полной мере не продемонстрируют все свои видовые особенности: цвет и форму листьев, размеры и т. д.

Обратите внимание! В среднем всхожесть семян хойи составляет около 80 %.

Если же через 1-2 недели после посева росточки так и не появились, дольше ждать не нужно, заставить их появиться невозможно. Причин этому может быть несколько:

• посадочный материал слишком старый, поэтому потерял свою жизнеспособность;
• произошло загнивание корешков из-за чрезмерного увлажнения почвы.

Найти в свободной продаже семена хойи довольно трудно. В домашних условиях обычно они не завязываются. Единственный шанс — купить в интернет-магазине. Но нет никакой гарантии, что посадочный материал будет действительно хорошего качества. Куда проще приобрести черенок в специализированном магазине, а некоторые даже предлагают под заказ редкие и особенно красиво цветущие сорта.

Учитывая, насколько просто размножать домашнюю лиану, не удивительно, что число ее поклонников так велико. Красивая зелень и цветы — настоящее украшение любого дома, доступное даже начинающим цветоводам. А из черенков всегда можно сделать живой подарок, достаточно подобрать подходящий горшочек!

где выращивают в мире на плантациях, технология возделывания, почему растет в воде, как выглядит и как его собирают

Употребляя рис на завтрак, обед или ужин, редко кто задумывается о том, где произрастает эта культура и какие необычные условия нужны, чтобы получить урожай. Из статьи вы узнаете, где растет рис, как выглядит и как его вырастить в домашних условиях.

Содержание статьи

Особенности культуры

Рис — однолетняя культура-гидрофит

. Для его возделывания требуется затопленная почва, орошение или большое количество осадков. Он любит солнце, пасмурная погода мешает развитию. Оптимальная температура для роста риса — +25…+28°С. При снижении температуры до 15°С его развитие замедляется. А если температура понизится до 12°С, это приведет к пустозерности.

Обеспечение питанием влияет на урожайность злака. Дефицит азота приводит к замедлению роста и уменьшению урожая, а его избыток — к увеличению вегетативной массы, уменьшению массы зерен и поражению грибком.

Ботаническое описание

Рис имеет мочковатую корневую систему, которая проникает на глубину 20-30 см и состоит из главного и придаточного корней. Отличительная черта его корней — наличие ткани с воздухопроводящими полостями (аэренхимы). Благодаря ей корневая система насыщается кислородом, поступающим от стеблей и листьев.

Стебель представляет собой соломину высотой до 1,5-2 м.

Листья длинные и узкие с хорошо выраженной жилкой. Длина листа — около 50 см, ширина — 1 см.

Соцветие — метелка, достигающая до 30 см в длину. Плод — зерновка, находящаяся в цветковых чешуях.

Рис — самоопыляющееся растение. Перекрестное опыление происходит редко.

Рис в севообороте

Рис возделывают по специальным пяти – девятипольным севооборотам. Чтобы создать благоприятную среду для повторного посева, делают перерывы. В это время поля освобождают от затопления и сажают на них суходольные растения — люцерну, донник, клевер — либо оставляют территории под паром.

Основное назначение парового звена — проведение мелиоративно-ремонтных работ. В это время выращивают растения-сидераты для улучшения структуры почвы, обогащения ее питательными элементами и угнетения роста сорных трав.

Лучшие растения для выращивания под паром:

• вика;
• рапс;
• горох;
• чина;
• смесь бобово-злаковых культур;
• гречиха.

После парового поля рис засевают в течение двух лет, а после травы и бобовых — в течение трех.

Использование чистого пара в севообороте риса не зарекомендовало себя. В этом случае происходит потеря такого важного питательного элемента, как азот, потому что после нового затопления он уходит в атмосферу, восстанавливаясь до свободного молекулярного азота из нитратной формы.

Как и где растет рис

Рис распространен в Китае, Индонезии, Вьетнаме, Индии и Южной Америке. Подходящим климатом для его возделывания считается тропический, но он встречается и в субтропиках. В России культура произрастает в Краснодарском и Приморском краях, Астраханской и Ростовской областях, а также в Чеченской Республике и Калмыкии.

Различают несколько способов выращивания:

1. Суходольное рисоводство используется в местностях с редкими осадками, теплым летом и низменной болотистой территорией.
2. Поливное рисоводство — наиболее популярный метод. Для этого территории специально затапливают — выкопанные рвы наполняют водой, которую за полмесяца до снятия урожая спускают, чтобы почва немного подсохла.
3. Лиманное рисоводство — малоэффективный способ, используемый лишь в некоторых областях на юге и востоке Азии. Для выращивания культуры используют заливы рек и места с паводками.

Выращивание в воде

Несмотря на то, что рис хорошо растет на обычной почве, выращивание в воде увеличивает урожайность. Почему рис лучше растет в воде? Это обусловлено тем, что сорная трава не может расти в таких условиях, и больше пространства остается для развития полезных злаков. Также из воды растение получает питание.

Особенности выращивания в зависимости от вида риса

По форме и размеру зерна рис делится на три вида:

• длиннозерный;
• среднезерный;
• круглозерный.

Технология выращивания разных видов одинаковая.

При выращивании риса сначала сеют рассаду. Через 30-50 дней ее высаживают в грунт, залитый водой. После того как зерна созреют, воду сливают и дают растению просохнуть.

Затем урожай собирают и дополнительно просушивают, после чего зерна подвергают обмолоту. Потом с них снимают шелуху и, если нужно, верхний слой — для получения белого риса.

Агротехника

Для получения большого урожая соблюдают технологию возделывания:

1. Севооборот. При выращивании риса нельзя пренебрегать его условиями.
2. Обработка почвы. Способ зависит от типа почвы. Для чернозема подходит вспашка отвальными плугами на глубину 20 см, для солончаков — безотвальная вспашка на ту же глубину. Солонцеватые почвы обрабатывают на глубину до 15 см мелкой вспашкой. Если растут болотные растения, вспахивают на расстояние больше глубины залегания корней. Затем поле выравнивают и при необходимости рыхлят.
3. Посев риса. В основном применяют рядовой способ посева. Норма высева семян — 5,5-7 млн всхожих зерен на 1 га, глубина заделки — 1,5-2 см.
4. Удобрения. Рису нужны азотные, калийные и фосфорные удобрения. На тонну рисового зерна требуется 24,2 кг азота, 12,4 кг фосфора, 30 кг калия. Органические удобрения вносят во время мелиоративных работ или парового звена.
5. Уход за посевами включает подкормку, опрыскивание, десикацию, сеникацию, борьбу с болезнями и вредителями.
6. Уборка урожая. Убирают раздельным способом и прямым комбайнированием с предварительной обработкой десикантами.

Где в мире выращивают плантации риса

Хотя родиной этого злака считается Азия, теперь он растет по всему миру. Лидеры по производству риса — Китай и Индия, Индонезия, Бангладеш, Вьетнам, Таиланд и Мьянма.

В разных странах выращивают различные сорта:

• длиннозерный — Азия, Австралия, Америка;
• круглозерный — Китай, Россия, Украина, Италия;
• среднезерный — Италия, Испания, Северная Америка, Австралия;
• жасмин — Таиланд;
• басмати — север Индии и Пакистана;
• черный — Китай;
• красный — Франция;
• дикий — США, Канада.

В Китае

В Китае рис выращивают на полях, залитых водой. Сначала семена высевают в специальном парнике в грунт, представляющий собой смесь грязи с водой. В таком грунте выживают наиболее стойкие растения. Когда рассада вырастет до 10 см, ростки кидают в воду. Когда их длина достигнет 50 см, начнется цветение.

В это время формируются зерна. После сбора урожая рис раскладывают прямо на дороге, давая ему просохнуть, затем отвозят на склад. При оптимальных условиях рис хранится год, в фасованном виде — до 3 лет.

В России

В России рис начинают выращивать в мае. Сначала землю тщательно поливают. Когда ростки достигнут в высоту 15-20 см, поля заливают водой. Верхушки ростков должны торчать над водой. За 15-20 дней до уборки поля осушают.

В Индии

В Индии рис предварительно проращивают 1-2 месяца. Проросшие зерна помещают в грунт с водой. Воду с рисовых полей сливают перед сбором урожая или прополкой. Собирают урожай до того, как листья растений пожелтеют. С одного поля в Индии снимают урожай 2-4 раза в год.

В Таиланде

В подготовленный грунт кидают зерна и дожидаются появления ростков. Далее ростки собирают и равномерно рассаживают. Злаки выращивают 30 дней. Во время сбора урожая рис срезают и зерно выбивают в отдельную емкость. Затем его очищают от мусора, шлифуют либо подвергают пропарке.

В Италии

Сначала почву подготавливают, заливают чеки водой, затем засевают зерна с тракторов. Через неделю поля осушают для укоренения зерен. Затем снова заливают на 10 см и поддерживают такой режим. Сбор урожая начинают, когда стебли достигают в высоту 1,5 м. Собранное зерно сушат, фасуют и складируют.

В Японии

По полю разбрасывают перегной, затем его затопляют и вспахивают. Это болото становится питомником для семян риса, которые туда высевают. Когда побеги вырастут до 20 см, их пересаживают вручную на поле. Почву между рядами растений пропалывают, рыхлят и затем мульчируют. В качестве мульчи используют рисовую солому. Она способствует удержанию воды на поле, которое остается затопленным 3 месяца. Урожай убирают вручную или с помощью комбайнов.

Урожайность

В странах-лидерах по выращиванию риса урожай собирают несколько раз в год.

Справка. Средняя урожайность риса составляет около 60 ц/га. Максимальная урожайность — до 150 ц/га.

Урожайность риса во многом зависит от севооборота. В зависимости от того, какие культуры выращивали перед ним, получали большее или меньшее количество злаков. Если рис сажали после выращивания парозанимающих культур, его урожайность повышалась по сравнению с посевами риса, перед которыми промежуточные культуры не возделывались. Более высокая продуктивность была, когда промежуточные растения выращивали в качестве сидератов.

Как собирают рис

Перед уборкой урожая воду сливают и просушивают поле, чтобы по нему смогла проехать уборочная техника. Примерно через 15 дней после ухода воды можно приступать к снятию урожая.

Уборку начинают, когда созреет зерно. Это можно понять по цвету оболочек зерновки.

Рис убирают двухфазным способом, потому что зерна созревают не одновременно. Когда влажность зерен в вилках составит 15%, рис обмолачивают. При большой урожайности требуется двойной обмолот, чтобы снизить потери и повреждение зерна.

Для ускорения созревания проводят сеникацию, а для засыхания стеблей и получения возможности однофазной уборки – десикацию.

Однофазный способ применяют при изреженном стеблестое или ранних заморозках.

Сразу после сбора зерна обрабатывают — подсушивают и пропускают через очистительные машины.

Можно ли выращивать рис в домашних условиях

Опытные фермеры выращивают рис на своем участке и даже получают урожай.

Не во всех регионах получится вырастить эту культуру, так как для нее нужны специальные условия:

• дневная температура в течение 3-6 месяцев +22…+25°С, ночная — не ниже +15°С;
• участок должен прогреваться солнцем;
• возможность сделать затопленную грядку;
• наличие системы орошения.

Чтобы вырастить рис у себя в огороде, следует знать, как правильно за ним ухаживать.

Как это сделать

Рис любит тепло и влагу. Подберите подходящее место — оно должно быть солнечным. Сажать нужно поздней весной, когда температура уже стабильно высокая. Некоторые фермеры сажают зерна сразу в грунт, но более эффективен рассадный способ.

Подготовьте грядки или ящики. Уберите сорняки, вскопайте и полейте грядку. Грунт всегда должен быть влажным.

Подготовьте посадочный материал — замочите его на 12-36 часов в воде комнатной температуры. Сделайте на грядке ямки или борозды, наполните водой и распределите в них пророщенные зерна. Засыпьте сверху землей и еще раз полейте.

Когда всходы вырастут до 2 см, грядку залейте водой на 2,5 см.

Если ростки сидят слишком близко друг к другу, проредите посадку. Расстояние между всходами должно быть 30 см.

Справка. При использовании рассадного способа в грунт высаживают ростки, выросшие до 2 см.

Созревание зерен занимает 3-4 месяца. Перед сбором урожая нужно дать воде высохнуть или откачать ее. Через две недели злак можно собирать, когда зерно просохнет и пожелтеет. Стебли срезают прямо под колосьями и складывают в сухом, проветриваемом помещении на 2-4 недели, чтобы зерно окончательно просохло. Затем зерна снимают и просушивают еще раз в духовом шкафу. Рис остужают и очищают от оболочки. Получится рис, выращенный своими руками.

Заключение

Выращивание риса — трудоемкий процесс, требующий технического оснащения и глубоких знаний. Для получения вкусного и полезного злака требуются специально созданные условия. На домашнем участке его можно вырастить, приложив много усилий.

% PDF-1.6 % 872 0 объект > endobj 492 0 объект > endobj 1102 0 объект > поток 2012-03-01T15: 44: 51 + 08: 002008-03-25T11: 06: 08 + 08: 002012-03-01T15: 44: 51 + 08: 00 Adobe Photoshop CS2 Windowsapplication / pdfuuid: ce645f4f-e4cb-4ec7- 87e8-064bc2b633eauuid: dcff0c44-3b08-4bec-b6fd-60788dc497ce Adobe Photoshop для Windows — подключаемый модуль преобразования изображений конечный поток endobj 1081 0 объект > / Кодировка >>>>> endobj 843 0 объект > endobj 614 0 объект > endobj 615 0 объект > endobj 616 0 объект > endobj 617 0 объект > endobj 618 0 объект > endobj 619 0 объект > endobj 620 0 объект [734 0 R] endobj 621 0 объект [735 0 R] endobj 622 0 объект [736 0 R] endobj 623 0 объект [737 0 R] endobj 624 0 объект [738 0 R] endobj 625 0 объект [739 0 R] endobj 626 0 объект [740 0 R] endobj 627 0 объект [741 0 R] endobj 628 0 объект [742 0 R] endobj 629 0 объект [743 0 R] endobj 630 0 объект [744 0 R] endobj 631 0 объект [745 0 R] endobj 632 0 объект [746 0 R] endobj 633 0 объект [747 0 R] endobj 634 0 объект [748 0 R] endobj 635 0 объект [749 0 R] endobj 636 0 объект [750 0 R] endobj 637 0 объект [751 0 R] endobj 638 0 объект [752 0 R] endobj 639 0 объект [753 0 R] endobj 640 0 объект [754 0 R] endobj 641 0 объект [755 0 R] endobj 642 0 объект [756 0 R] endobj 643 0 объект [757 0 R] endobj 644 0 объект [758 0 R] endobj 645 0 объект [759 0 R] endobj 646 0 объект [760 0 R] endobj 647 0 объект [761 0 R] endobj 648 0 объект [762 0 R] endobj 649 0 объект [763 0 R] endobj 650 0 объект [764 0 R] endobj 651 0 объект [765 0 R] endobj 652 0 объект [766 0 R] endobj 653 0 объект [767 0 R] endobj 654 0 объект [768 0 R] endobj 655 0 объект [769 0 R] endobj 656 0 объект [770 0 R] endobj 657 0 объект [771 0 R] endobj 658 0 объект [772 0 R] endobj 659 0 объект [773 0 R] endobj 660 0 объект [774 0 R] endobj 661 0 объект [667 0 R] endobj 667 0 объект > endobj 668 0 объект > endobj 390 0 объект > endobj 868 0 объект > endobj 392 0 объект > поток HWkoDUB3xuS’v p * v2) @]) PxA9w ^ I̽s9 ^ ON ‘N ~% ٭ɗ W | k = 7-N (-Uvrza [vc1M7 ٍ | ok // gx’X? $ _ 0_? Y * +) ߳ MXԁ> «7 $ ~ Ly4x2k {2sѵu0 ^ fϳh) oEWFI ~ ௱ z & ekpj_Ғ? 3Nu۵

Frontiers | Мутагенез в рисе: основа для создания нового супер-растения

Введение

Рис ( Oryza sativa L. ) среди всех сельскохозяйственных культур продемонстрировала самые высокие достижения в функциональной геномике за последние десятилетия. Это диплоидный вид с небольшим геномом по сравнению с другими культурными злаками (Moin et al., 2017). Кроме того, широкое использование методов генетической трансформации, синтения с другими видами сельскохозяйственных культур и диверсифицированный источник родственной и тесно связанной зародышевой плазмы в огромной степени способствует преимуществам использования риса в качестве генетической системы для функционального анализа (Lo et al., 2016 ). Однако элитные сорта риса демонстрируют узкую генетическую изменчивость из-за многократного использования схожих генотипов, т.е.е., с одинаковым идеотипом в блоках скрещивания. Понимание генетической основы и функции данного гена может помочь селекционерам вывести новые, более продуктивные и устойчивые к стрессу сорта. Следует иметь в виду, что большинство важных с точки зрения агрономии признаков имеют сложную наследственность и поэтому их труднее улучшить. В этом случае мутантный или вариантный аллель может быть обнаружен и легко интрогрессирован путем проведения общегеномных ассоциативных исследований (GWAS) в популяциях, включая мутантные генотипы.

Мутации можно использовать как инструмент для функциональных исследований генов и создания генетической изменчивости. Анализ мутантов с помощью прямой генетики, то есть от фенотипа к гену, или обратной генетики, то есть от гена к фенотипу, может быть использован для понимания функции гена (Lo et al., 2016). Однако частота спонтанных мутаций у высших растений невысока и составляет от 10 ^-5 до 10 ^-8 (Jiang and Ramachandran, 2010). Таким образом, мутагенез является важной стратегией увеличения частоты мутаций (Maluszynski et al., 2000; Da Luz et al., 2016), что позволяет изучать функциональную геномику и разрабатывать новые генотипы.

Мутации могут быть случайным образом индуцированы генотоксичными агентами или вставками ДНК, и то и другое может приводить к увеличению или потере функции генов. Другая форма заключается в индукции прямых мутаций с целью изменения структуры целевого гена. Сообщалось о некоторых важных коллекциях мутантов риса, созданных с целью функциональных исследований, а список библиотек мутантов был предоставлен Hirochika et al.(2004). В библиотеке можно найти коллекции мутантов для случайно индуцированных мутаций (Maluszynski et al., 2000) и инсерционных мутаций транспозонами (van Enckevort et al., 2005), ретротранспозоном (обзор в Hirochika, 2010), вставками Т-ДНК ( Zhang et al., 2006; Hsing et al., 2007; Piffanelli et al., 2007) и даже мутантные линии Arabidopsis, экспрессирующие полноразмерную кДНК риса (Sakurai et al., 2011). Разработанные мутанты могут помочь определить путь или могут быть непосредственно использованы в сельском хозяйстве, классическим примером являются сорта риса, устойчивые к имидазолиноновым гербицидам (Sudianto et al., 2013).

Учитывая важность разработки мутантов риса для понимания функции генов и создания генетической изменчивости, в этом обзоре сообщается о самых последних достижениях в идентификации функции генов и раскрывается генетический резервуар, полученный в результате мутаций в геноме риса.

Случайные мутации

Мутации являются основным источником генетической изменчивости, и искусственные мутации могут быть вызваны мутагенами (Wei et al., 2013; Oladosu et al., 2016). Существует три основных инструмента мутагенеза: биологические агенты, такие как транспозоны, ретротранспозоны и Т-ДНК; физические агенты, такие как ионизирующие излучения, или химические агенты, такие как алкилирующие агенты; и азиды (обзор в Serrat et al., 2014). Данные Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций / Международного агентства по атомной энергии — База данных мутантных разновидностей (ФАО / МАГАТЭ-МВД) (2019) сообщает о разработанных и официально выпущенных мутантах, в общей сложности 3275 образцах 225 видов.Освободившиеся мутанты в основном состоят из видов злаков (47%), причем большинство (25%) составляют мутанты риса (рис. 1А). 823 мутантных сорта риса распределены в 30 странах, при этом на Китай и Японию приходится 35,6% и 26,8% от общего количества соответственно (рис. 1B).

Рис. 1 Распределение мутантов согласно данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций / Международного агентства по атомной энергии — База данных мутантных разновидностей (ФАО / МАГАТЭ-МВД, 2019). (A) Распределение мутантов по видам; (B) Распределение мутантов по странам (карта).

В рисе изменения в структуре генов могут быть случайным образом вызваны разрывом ДНК под действием физических или химических агентов (Jain, 2010; Wei et al., 2013; Yang et al., 2013). Мутагенез у риса выгоден из-за его небольшого генома, т. Е. Небольшая популяция требуется для насыщения всего генома и обеспечения более крупного аллельного ряда для использования в мутагенезе (Wu et al., 2005; обзор Wang et al., 2013). Случайные мутации, вызванные физическими и химическими агентами, применялись для создания генетической изменчивости и для функциональных исследований генов риса (таблица 1).

Таблица 1 Химические и физические мутагены, применяемые для индукции случайных мутаций в рисе.

Действительно, степень мутации зависит от ткани, дозировки и времени воздействия (Parry et al., 2009). Важным шагом при получении мутантной популяции химическими или физическими средствами является определение LD ₅₀ (обзор Talebi et al., 2012). Ожидается, что самая высокая частота мутаций будет при обработке, при которой погибает 50% обработанного материала (Jain, 2010).В этом смысле LD ₅₀ соответствует дозе, убивающей половину популяции, подвергшейся лечению (обзор Talebi et al., 2012). У риса мутанты были получены из незрелых зародышей (Ookawa et al., 2014), каллусов, полученных из семян (Serrat et al., 2014), и культур суспензий клеток (Chen et al., 2013). С семенами, однако, проще обращаться, и они не требуют специальной структуры, поэтому они являются наиболее широко используемым материалом (Da Luz et al., 2016; Oladosu et al., 2016). Когда семена мутагенизированы, важно стандартизировать мутагенную абсорбцию семян посредством предварительного замачивания семян в дистиллированной воде, поскольку это также активирует метаболизм семян и способствует действию мутагена.

В селекции растений индукция и идентификация семенных мутаций — простой процесс. После получения мутантной популяции и идентификации мутации семена мутантного растения составляют следующее поколение, в котором будет анализироваться фенотип для поиска эффектов мутации (Henry et al., 2014) (рис. 2).

Рисунок 2 Схема получения мутантной популяции риса. Мутагенез осуществляется с помощью химической или физической обработки семян популяции M ₀ .Растения M ₁ происходят от каждого обработанного семени M ₀ . Семена растений M ₁ сформируют популяцию M ₂ , в которой будет проведен анализ ДНК для поиска мутаций. Семена растений M ₂ сформируют популяцию M ₃ , и следующие популяции будут получены таким же образом. адаптировано из (Tai, 2017)

Случайные мутации, вызванные химическими агентами

Преимущество использования химических агентов заключается в возможности улучшить один или два признака, избегая при этом нежелательных изменений (Jeng et al. , 2011). Химические мутагены этилметансульфонат (EMS), метилметансульфонат (MMS), фторид водорода (HF), азид натрия (SA), N-метил-N-нитрозомочевина (MNU) и гидроксиламин (H ₃ NO) являются химическими веществами. наиболее часто используется в растениях (Parry et al., 2009). Эффект от химической обработки проявляется в виде молчаливых или миссенс-мутаций (50%), тогда как наблюдаются только 5% бессмысленных мутаций (Nawaz and Shu, 2014).

Этилметансульфонат

Этилметансульфонат (EMS) вызывает мутации за счет алкилирования гуаниновых оснований, что приводит к (неправильному) совпадению с тимином, а не с цитозином, что приводит к переходам от G / C к A / T (обзор в Talebi et al., 2012). Однако с меньшей частотой EMS может вызывать трансверсии G / C в C / G или G / C в T / A посредством гидролиза 7-этилгуанина или переходы A / T в G / C через несовпадения 3-этиладенина (обзор в Serrat et al. др., 2014). В рисе мутагенез EMS включает замачивание семян в растворе с известной концентрацией EMS, обычно от 0,2 до 2,0%. Время нахождения в растворе для замачивания составляет от 10 до 20 часов и учитывает чувствительность или летальную кривую используемого генотипа (обзор Talebi et al., 2012). Luz с соавторами (2016) сгенерировали 340 семейств мутантов риса, применив EMS 1.Сообщалось о 5% в течение 2 часов и о значительном различии между семьями, что указывает на эффективность дозы и времени воздействия при создании мутантов. Также сообщалось, что лечение EMS вызывает генетическую изменчивость у риса басмати (Wattoo et al., 2012). Для обработки EMS предварительно замоченные семена погружали в EMS 0,5, 1,0, 1,5 и 2,0% на 6 часов, предполагая, что дозы от 0,5% до 1,0% в течение 6 часов могут вызывать мутации в рисе. Поскольку мутагенез EMS вызывает большее количество нелетальных точечных мутаций, относительно небольшая популяция, ок.10 000 растений, необходимо, чтобы насытить геном мутациями. У диплоидных организмов обработка EMS (1,5%) может вызывать 1 мутацию каждые 294 килобайт (Till et al., 2007).

Отчеты показали, что применение EMS улучшает агрономически важные признаки. Одним из основных направлений мутагенеза риса является получение генотипа с фотосинтезом C4. Мутагенез с помощью EMS позволил получить мутанты, влияющие на важные черты, такие как увеличение числа жилок и скорость фотосинтеза в листьях, а также уменьшение количества межжелковых клеток мезофилла (Feldman et al., 2014; Фельдман и др., 2017). Также были получены признаки устойчивости к абиотическому стрессу. Среди них были увеличены такие характеристики засухоустойчивости, как длина корня, объем корней и масса корня (Mohapatra et al., 2014). Устойчивость к жаре и засухе была связана с низким накоплением АФК, что связано с этими стрессами, а мутанты, показывающие более высокое удержание хлорофилла, также были термостойкими (Panigrahy et al., 2011). Кроме того, был идентифицирован термостойкий мутант с более высокой эффективностью фотосистемы II (Poli et al., 2013). Эти исследования продемонстрировали потенциальное использование мутации для развития более урожайного и устойчивого к стрессу генотипа. С другой стороны, мутагенез EMS использовался в исследованиях обратной генетики для определения функции генов. Ген OsHAC4 , который кодирует роданазеподобный белок, был идентифицирован и, как сообщается, участвует в механизме толерантности к арсенату и в накоплении мышьяка в рисе (Xu et al., 2017a).

N-Метил-N-нитрозомочевина

Несомненно, N-метил-N-нитрозомочевина (MNU) является наиболее часто применяемым мутагеном в рисе (FAO / IAEA, 2019) (Рисунок 3A).MNU — это монофункциональный алкилирующий агент, обладающий высокой реакционной способностью по отношению к атомам кислорода в молекуле ДНК. Мутация начинается с присоединения алкильных групп к азотистым основаниям, в основном гуанину и цитозину. Генерация O ⁶ -алкилгуанина, индуцированная обработкой MNU, способствует переходам от G / C к A / T через несовпадения с тимином во время репликации ДНК (обзор Satoh et al., 2010). Однако наличие O ⁶ -алкилгуанина не является случайным и зависит от фланкирующей последовательности 5 ’и 3’ гуанина, конформации ДНК и структуры хроматина. Если 5’гуанин фланкирован 5’аденином и 3’цитозином, вероятность образования O ⁶ -алкилгуанина увеличивается в 10 раз (Sendowski and Rajewsky, 1991). Сообщалось, что мутагенез с использованием MNU в рисе более эффективен в развивающихся клетках, чем в сухих семенах (Satoh et al., 2010). Когда применяется лечение MNU, ожидается одна мутация каждые 135 Kb (Satoh et al., 2010).

Рис. 3 Мутагены, применяемые в мутагенезе риса, в соответствии с данными Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций / Международного агентства по атомной энергии — База данных мутантных сортов (FAO / IAEA-MVD, 2019). (A) Химические мутагены; (B) Химические и физические агенты; (C) Физические мутагены.

Мутагенез с обработкой MNU широко применяется и влияет на ряд физиологических процессов растений, что приводит к открытию функций генов и увеличению генетической изменчивости. С помощью молекулярных и фенотипических маркеров локус stg (t) (ответственный за признак Stay Green) был картирован на хромосоме 9 (Cha et al., 2002). Пятнистые мутанты листьев ( spl28 ) были идентифицированы и показали образование гиперчувствительных повреждений, ведущих к инициации старения листьев (Qiao et al., 2010). Ген Young Seedling Stripe2 ( YSS2 ) также был идентифицирован и охарактеризован как участвующий в биосинтезе хлоропластов (Zhou et al., 2017). Кроме того, был идентифицирован мутант Plastochron1 ( Pla1 ), который участвует в развитии зачатков листьев и влияет на время вегетативного роста листа (Miyoshi et al., 2004). Было обнаружено, что ген LGF1 ( Leaf Gas Film 1 ) контролирует гидрофобность листьев и образование газовых пленок (Kurokawa et al., 2018).

Ген транспортера оттока кремния Low Silicon Rice 2 ( Lsi2 ) также был идентифицирован с помощью мутагенеза MNU (Ma et al. , 2007). Ген Zebra3-1 ( z3-1 ), также связанный с транспортом, был охарактеризован как вовлеченный в транспорт и распределение цитрата во время развития листа (Kim et al., 2018a). Кроме того, мутантные линии с более высоким накоплением кадмия показали низкую экспрессию OsHMA3 , что свидетельствует об участии этого гена в накоплении кадмия (Shao et al., 2017). Были идентифицированы гены, участвующие в оттоке ауксина и передаче сигналов. Ген Ospin-Formed2 ( Ospin2 ), который кодирует белки-носители ауксинового оттока (Inahashi et al., 2018), и Giant Embryo ( GE ), который контролирует экспрессию генов, отвечающих за ауксин и циклин ( Chen et al., 2015).

Результаты, полученные с использованием MNU, также помогают понять реакцию риса на биотические стрессы. Было обнаружено, что Blast Lesion Mimic ( BLM ) придает устойчивость к грибку (Jung et al., 2005). Другая мутантная линия, XM14, показала устойчивость к шести расам Xanthomonas oryzae pv. oryzae , в котором был идентифицирован ген Xa42 , , ответственный за ответы устойчивости (Busungu et al., 2016).

Кроме того, благодаря мутагенезу MNU было достигнуто лучшее понимание эмбриогенных процессов у риса. Сообщалось, что гены Shootless2 ( SHL2 ), SHL4 / Shoot Organization2 ( SHO2 ) и SHO1 участвуют в развитии нормальной апикальной меристемы побега (SAM) (Nagasaki et al., 2007). Также был идентифицирован Lonely Guy ( LOG ), активирующий цитокинин и регулирующий активность SAM (Kurakawa et al., 2007).

Индукция мутации с помощью MNU также ориентирована на урожайность и качество зерна, которые, несомненно, являются наиболее важными агрономическими признаками. Был идентифицирован аллель Aberrant Panicle Organization1-1 ( APO1-1 ), участвующий в архитектуре соцветий, идентичности органов цветка и производстве листьев (Ikeda et al., 2005). Также сообщалось, что ген апикального аборта метелки ( PAA-Hwa ) участвует в идентификации метелки (Akter et al. , 2014). Благодаря введению генов indica, , SSIIa и GBSSI в мутантный генотип BEIIb japonica удалось получить линии с более высоким содержанием резистентного крахмала и амилозы (Itoh et al., 2017). Ген Floury Endosperm8 ( FLO8 ) был идентифицирован как регулятор генов, связанных с биосинтезом крахмала (Long et al., 2017). Что касается урожайности и формы семян, то было сообщено, что Dense and Erect Panicle 2-3 ( DEP2-3 ) играет роль в размере и форме семян риса (Seo et al., 2017). Содержание масла в рисовых зернах было изменено обработкой MNU, и были также идентифицированы мутантные линии, показывающие повышенное содержание триацилглицерина (Sakata et al., 2016). В семенах риса также было повышено содержание флавоноидов, фенольных соединений и антиоксидантная активность (Kim et al., 2018b). Описанные исследования ясно демонстрируют эффективность индукции мутации в рисе, обработанном MNU, и его потенциальное применение в функциональной геномике и улучшении риса.

Азид натрия

Азид натрия (SA-NaN ₃ ) является ионным соединением, и его мутагенность опосредуется органическим метаболитом (аналог L-азидоаланина) азидного соединения, генерируемого ферментом O-ацетилсеринсульфгидрилазы (Gruszka et al. al., 2012). Этот метаболит проникает в ядро ​​клетки и взаимодействует с ДНК, создавая точечные мутации в геноме. У риса SA преимущественно вызывает переходы от G / C к A / T, и аналогичные последовательности в сайте мутации были идентифицированы как 5’-GGR-3 ‘(Tai et al., 2016). Выявленная частота мутаций составляла от 1,4 до 2,9 мутаций на Мб. Известно, что мутагенный эффект СК сильно зависит от pH раствора и может усиливаться при обработке проросших семян (Gruszka et al., 2012).

Важные результаты были получены в результате обработки SA в отношении улучшения риса.Suweon 542 — это мутантный рис, который потенциально может применяться при производстве рисовой муки, с мучными зернами и небольшими и менее деградированными частицами крахмала (Mo et al. , 2013). У этого мутанта рецессивный локус flo7 (t) объясняет 92,2% вариации зерновой муки. Обработка СК красным рисом также увеличивает количество протоцианидинов, γ-оризанола, витамина Е и накопление железа (Jeng et al., 2011). Также наблюдались повышенные количества железа и цинка в шлифованном зерне, содержание крахмала и амилозы и производство нового ароматного риса (Lin et al., 2011, Jeng et al., 2012, Lin et al., 2014). Линии, устойчивые к абиотическому стрессу, также были получены с обработкой SA. Сообщалось, что солевой гиперчувствительный мутант 1 ( shs1 ) играет роль в метаболизме антиоксидантов и гомеостазе Na ⁺ в условиях солевого стресса (Lin et al., 2016). Было обнаружено, что ген tms8 участвует в генетической мужской стерильности, вызванной температурой (Hussain et al., 2012).

Хотя SA менее заметен, чем EMS и MNU, он является альтернативным инструментом мутагенеза и может создавать изменчивость для функциональной геномики и селекции риса, соответственно.

Колхицин для индукции полиплоидов

Полиплоидизация — важное событие для эволюции растений. Когда плоидность увеличивается, урожай растений имеет тенденцию к увеличению, а иногда органы имеют тенденцию к увеличению. Этот феномен предполагает полиплоидизацию как стратегию совершенствования производства более качественных растений риса. Колхицин — это химический мутаген, обычно используемый для индукции удвоения хромосом. Это агент, разрушающий митоген, который воздействует на микротрубочки, которые организуют хромосомы на одной стороне клетки, способствуя симметричному делению клетки (обзор в Alemanno and Guiderdoni, 1994).Индукция полиплоидизации риса обычно осуществляется путем обработки колхицином каллуса, полученного из пыльников или посевных культур (Alemanno and Guiderdoni, 1994; Premvaranon et al., 2011; Zhang et al., 2017). В некоторых случаях индукция полиплоидии вызывает перестройки генома, которые могут отрицательно сказаться на производстве семян. После длительного периода исследований были получены две полиплоидные линии риса с генами Polyploid Meiosis Stability ( PMeS ) из потомков полиплоидных гибридов от скрещиваний индика-японика . Линии PMeS-I и PMeS-II показали разные признаки по сравнению с другими полиплоидными линиями, такие как повышенный урожай семян и стабильность мейоза (Cai et al., 2007).

С целью изучения гетерозиса у риса были разработаны две полиплоидные линии риса с фотопериодической и термочувствительной генной мужской стерильностью. Эти линии показали высокую способность к перекрестному опылению, изменения плодородия и высокую способность к комбинированию. Гибриды, полученные от этих линий, показали высокий уровень гетерозиса и потенциал повышения урожайности и качества рисового зерна (Zhang et al., 2017). Транскриптом неотетраплоидов риса выявил группу генов, связанных с фертильностью и гетерозисом. Среди них были выявлены факторы транскрипции, метилтрансферазы, гены, связанные с фотосинтезом, метаболические процессы, транспорт, фертильность, устойчивость, эпигенетические элементы, мейоз и ретротранспозоны, что свидетельствует о сложности регуляторных механизмов, связанных с фертильностью и гетерозисом (Guo et al. , 2017). Это демонстрирует, что индукция полиплоидии может быть способом повышения гетерозиса у самокрещающихся растений, таких как рис.

Чтобы понять регуляторные механизмы, связанные с дупликацией генома у риса, были проведены различные исследования. Анализ метилирования ДНК в автотетраплоиде риса выявил гиперметилирование мобильных элементов (ТЕ) класса II по сайтам CHG и CHH. Увеличение метилирования ТЕ ингибирует его транспозицию, стабилизируя целостность хромосомы, и может подавлять экспрессию соседних генов, потенциально уменьшая вредные эффекты дозировки этих генов (Zhang et al., 2015). Авторы предположили, что гиперметилирование может быть фактором ответа на «геномный шок», чтобы помочь неоаутополиплоидам адаптироваться к эффектам, вызванным дозировкой этих генов.

Что касается реакции на абиотический стресс, удвоение хромосом у риса привело к повышенной устойчивости к засолению (Tu et al., 2014). Кроме того, автотетраплоиды проявляли большую устойчивость к соленому стрессу во время прорастания и снижали уровень смертности во время начального роста. Кроме того, автотетраплоидный рис имел более высокое содержание пролина и растворимого сахара, а также снижение содержания малонового диальдегида по сравнению с диплоидным рисом (Jiang et al., 2013).

Технология синтетического аллополиплоидного риса (DSAR) была разработана для производства аллополиплоидного риса, который включает гибридизацию с отдаленными генотипами после удвоения хромосом (Zhang et al., 2014). Технология DSAR включает скрещивание дикого риса с последующим спасением эмбрионов и удвоением хромосом с обработкой колхицином.

Случайные мутации, вызванные физическими агентами

Физические агенты являются наиболее часто используемыми мутагенами в рисе (FAO / IAEA, 2018), что соответствует 91.6% найденных отчетов (Рисунок 3B). Ионизирующее излучение можно разделить на два класса по линейной передаче энергии. Более высокие скорости линейной передачи энергии происходят в альфа-пучках, нейтронах и тяжелых ионах, тогда как небольшие скорости обнаруживаются в γ-лучах, рентгеновских лучах и электронных пучках (Hwang et al. , 2014). Ионизирующее излучение производит активные формы кислорода (АФК), которые взаимодействуют с ДНК, вызывая окислительное повреждение, нуклеотидные изменения и одноцепочечные или двухцепочечные разрывы (обзор Roldán-Arjona and Ariza, 2009).

Гамма-лучи

Гамма-лучи (гамма-лучи) широко использовались для создания мутантов в рисе, примерно в 2000г. 92% мутантов риса, полученных с помощью физических агентов, были получены с помощью гамма-излучения (FAO / IAEA, 2018) (рис. 3C). Небольшие делеции (1–16 пб) были наиболее частым действием гамма-лучей на геном риса, однако также были обнаружены более крупные делеции (9,4–129,7 т.п.н.) и большие инверсии фрагментов (1284,8–3208,5 т.п.н.) (Morita et al., 2009 г.). Также были идентифицированы индели и замена одного основания с более высокой частотой гетерозиготных мутаций по сравнению с гомозиготными мутациями (Li et al., 2016c). Кроме того, обработка сухих семян привела к наследственным мутациям с частотами от 7,5 × 10 ^-6 до 9,8 × 10 ^-6 (Li et al. , 2016c). Отчеты показали, что гамма-лучи порождают генетическую изменчивость в широком диапазоне генотипов риса, что является эффективным инструментом для улучшения риса (Kole et al., 2008; Harding, 2012).

Мутанты, индуцированные γ-лучами, помогают идентифицировать гены, связанные со специфическими физиологическими процессами в растениях риса. Ген некротической летальности1 ( nec1 ), когда он гетерозиготен, контролирует процессы некроза листьев (Mbaraka et al., 2017). Анализы мутанта с ранним старением листа ( esl ) показали участие НАДФН-оксидазы в передаче сигналов абсцизовой кислоты (ABA) через продукцию радикалов O ₂ ^— (Li et al., 2018a). Гамма-лучи смогли создать генетическую изменчивость устойчивости к абиотическому стрессу, такую ​​как соленость в линиях ST-87 и ST-301 (Song et al., 2012), а также высоту растений, количество побегов, массу побегов и корней в целом. биомасса и длина метелки (Joshi et al., 2016). Толерантный к мышьяку тип 1 ( aatt1 ) продемонстрировал устойчивость к мышьяку в почве (Hwang et al. , 2017).

Также сообщалось об изменении содержания зерна риса. Мутант OASA1 показал повышенное хранение триптофана, что позволило исследователям определить, что на накопление триптофана в рисе влияет структура гена OASA1 (Chun et al., 2012). Мутант MRXII показал повышенное содержание токоферола, которое было связано с SNP, созданными в промоторе OsVTE2 , которые генерируют сайт связывания фактора транскрипции MYB (Hwang et al., 2014). Ароматный рис был также получен с помощью гамма-излучения. Эти линии показали повышенное содержание 2-ацетил-1-пирролина (2AP) и пониженное содержание γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) (Sansenya et al., 2017). Мутанты GM077 и GM645 показали более низкое и более высокое содержание амилозы, соответственно, что указывает на то, что γ-лучи также влияют на запасание крахмала в зернах риса (Kong et al., 2015).

Изменения ДНК с помощью γ-лучей также были целью проекта, направленного на превращение риса в растение C4. Измененная морфология листа ( alm ) показала уменьшение межжилковых расстояний между листьями, которое определяется размером клеток мезофилла, важной анатомической адаптацией для получения анатомии Кранца, типичной для растений C4 (Smillie et al. , 2012). Также, что касается клеточной структуры, было охарактеризовано участие Brittle Culm 3 ( BC3 ) во вторичном биосинтезе клеточной стенки (Hirano et al., 2010). Ген OsCLD1 / SRL1 ( Semi-Rolled Leaf 1 ) охарактеризован в синтезе клеточной стенки, целостности эпидермиса и путях гомеостаза воды (Li et al., 2017a). Zebra2 ( z2-2 ) был идентифицирован как связанный с накоплением тетра- цис -глюкопена (Han et al., 2012).

Ионно-лучевая радиация

Ионно-лучевая радиация (ИБР) отличается от гамма-лучей линейной передачей энергии и производит важные делеции размером более 1 Кбайт (обзор в Nawaz and Shu, 2014). Эффекты IBR были подтверждены на Arabidopsis thaliana . Это вызывает точечные мутации (большинство из них делеции) и межгенные перестройки в виде делеций, инверсий, транслокаций и вставок (обзор у Tanaka et al., 2010). DL ₅₀ ионов углерода оценивается в 30 Гр (220 МэВ) для генотипа Nipponbare (Maekawa et al. , 2003). После этого для генотипа Nipponbare были рекомендованы дозы до 20 Гр (23-40 кэВ / мкм) и 10 Гр (60-80 кэВ / мкм) ускоренного ионного излучения углерода и неона, соответственно, для получения растений с высокой выживаемостью. фертильность и с высокой частотой мутантов с дефицитом хлорофилла (Maekawa et al., 2003; Hayashi et al., 2007). IBR вызывает мутации с высокой частотой при относительно низкой дозе, а также вызывает широкий спектр фенотипов, не влияя на другие свойства растений, что является преимуществом при применении IBR для мутации риса (обзор в Ishikawa et al., 2012).

Используя IBR, была раскрыта роль некоторых важных генов в рисе. Мутации были получены в рисе, облученном ионами углерода, то есть был изменен ген OsNramp5 , что привело к снижению содержания кадмия в зернах (Ishikawa et al., 2012). Азотная бомбардировка также вызывает изменения некоторых важных характеристик, таких как высота растений, листья, покровы и цвет околоплодника (Phanchaisri et al. , 2007). PKOS1 , HyKOS1 (карликовый) и TKOS4 (высокий) мутанты были получены путем бомбардировки ионами азота с низкой энергией.Это позволило идентифицировать гены OsSPY и 14-3-3 , которые действуют как негативный регулятор гиббереллинов и репрессор RSG ( Repression of Shoot Growth ) соответственно (Phanchaisri et al., 2012 ).

Облучение быстрыми нейтронами

Облучение быстрыми нейтронами влияет на структуру ДНК, повреждая азотистые основания, способствуя стандартным разрывам. Также сообщалось об одном нуклеотидном замещении, вставках и дупликациях как о эффекте облучения быстрыми нейтронами (обзор в Li et al., 2016а). Недавно было секвенировано 1504 мутанта риса, генерируемых излучением быстрых нейтронов по генотипу Китааке (Li et al., 2017b). Было выявлено более 91 000 мутаций, затрагивающих 58% генов риса, в среднем по 61 мутации в каждой линии. Эти изменения включали замены отдельных нуклеотидов, делеции, вставки, инверсии, транслокации и тандемные дупликации.

Несмотря на серьезное повреждение ДНК, вызванное облучением быстрыми нейтронами, в нескольких отчетах этот инструмент применялся в качестве источника изменений в рисе.Однако были получены важные признаки качества рисового зерна. Изменения содержания амилозы были обнаружены у некоторых мутантных линий, при этом облучение не изменило структуру амилопектина (Mei, 2010). Была получена толерантность к токсичности железа, облучение быстрыми нейтронами вызвало изменения в гене FRO1 , отвечающем за повышение толерантности и более высокое накопление железа в зернах (Ruengphayak et al., 2015). Семена из генотипа риса, сверхэкспрессирующего Nh2 ( гомолог 1 NPR1) гена, обработанные облучением быстрыми нейтронами, предоставили информацию об иммунных ответах против бактериальной инфекции Xanthomonas oryzae pv. oryzae ( Xoo ) (Bart et al., 2010). Линия Nh2ox показала устойчивость к Xoo , а мутация потери функции гена SNL1 (супрессор Nh2-опосредованного поражения ) вызвала подавление устойчивости, приданной Nh2 . Недавно линия Nh2ox-54 была облучена быстрыми нейтронами и были идентифицированы новые гены, связанные с активностью SNL1 (Chern et al., 2014). Линии РНКи, полученные для генов CRK6 и CRK10 ( богатых цистеином рецептороподобных киназ ), демонстрируют фенотип snl1 , что указывает на то, что эти гены необходимы для иммунных ответов, опосредованных Nh2 .Недавно в облученной линии Nh2ox-54 был идентифицирован мутант по супрессору Nh2-опосредованного иммунитета 1 ( snim1 ), который подавляет устойчивость, придаваемую Nh2 (Chern et al., 2016).

Пучки быстрых нейтронов очень важны для функциональной геномики; однако в рисоводстве он еще не применялся. Охарактеризованные гены можно использовать для создания новых сортов, поскольку были изменены гены, отвечающие за важные агрономические признаки, такие как устойчивость к болезням, устойчивость к абиотическому стрессу и качество зерна.

Случайные мутации, вызванные другими химическими и физическими агентами

Излучение космических лучей применялось для индукции генетической изменчивости риса (Kim et al. , 2012). Получены семена, облученные γ-, космическими лучами или ИБР. Накопление АФК, пероксидазы, аскорбатпероксидазы и активность супероксида дисмутазы были увеличены в трех вариантах лечения, однако только гамма- и космические лучи смогли снизить содержание каротиноидов и хлорофилла. Кроме того, космическое излучение могло изменять профили генов с повышенной и пониженной регуляцией по сравнению с другими типами излучения.

Диэпоксибутан (DEB), бифункциональный алкилирующий агент, действует на азот 7 гуанинов и азот 3, 6, 7 и 9 аденинов, способствуя связям ДНК-ДНК и ДНК-белок (обзор в Nakhoda et al., 2012 ). Предполагается, что DEB вызывает небольшие делеции (1Kb) и точечные мутации (обзор Wu et al., 2005). Мутанты, полученные с обработкой DEB, показали изменчивость по толерантности к солености (Nakhoda et al., 2012). Толерантные мутанты поглощали меньше Na ⁺ и больше K ⁺ , увеличивая биомассу побегов и повышенную выживаемость по сравнению с диким типом.

Мутация — важный инструмент в создании генетической изменчивости. В этом смысле тестируются несколько агентов, которые оказывают различное воздействие на ДНК. Эти исследования чрезвычайно важны, поскольку они демонстрируют диапазон возможностей, с помощью которых может быть изменена структура ДНК.

Случайные мутации, вызванные комбинациями мутагенов

Помимо применения химического и физического мутагена, описанного выше, исследования продемонстрировали комбинированный эффект этих агентов на увеличение частоты мутаций.Сообщалось о сочетании химических и физических агентов в рисе, обработанном γ-лучами с последующим замачиванием семян EMS (Theerawitaya et al., 2011). Были выделены устойчивые к засолению мутанты, которые были способны выжить до 15 дней в 342 мМ растворе NaCl, в то время как чувствительные растения уже подверглись воздействию 171 мМ NaCl через 5 дней.

Комбинация γ-лучей, EMS и SA также использовалась в мутагенезе риса басмати (Siddiqui and Singh, 2010). Комбинация различных доз способствовала уменьшению высоты растений, размера метелки, количества метелок и веса 100 семян.Семена риса, облученные гамма-лучами, электронным лучом или периодической обработкой гамма-лучами, показали, что облучение электронным лучом представляет более высокую частоту мутаций по содержанию хлорофилла по сравнению с гамма-лучами и повторяющейся обработкой (Manikandan and Vanniarajan, 2017).

Инсерционный мутагенез

Инсерционный мутагенез основан на Т-ДНК (переносящая ДНК), транспозоне и ретротранспозоне, которые случайным образом вставляются в геном, генерируя широкий спектр мутаций (Sallaud et al., 2004).Эта стратегия была применена для получения мутантных популяций риса. Идентификации вставок риса способствует полная последовательность генома и эффективность методов заражения Agrobacterium tumefaciens , которые способствуют вставке Т-ДНК в геном риса (обзор в Wang et al., 2013). Однако есть опасения по поводу сомаклональной изменчивости, наблюдаемой в условиях in vitro , состояния, которое может маскировать индуцированные мутации. В этом смысле частота вариации in vitro у трансгенного риса оказалась низкой и незначительной при трансформации каллусов с использованием A.tumefaciens (Wei et al., 2016).

Вставка Т-ДНК Мутагенез

Несомненно, одним из наиболее широко используемых инструментов для идентификации функции генов является вставка Т-ДНК, которая может вызвать потерю функции, а через наблюдаемый фенотип — прямой ответ относительно их биологической функции (Lo и др., 2016). В противном случае это может привести к усилению функции, как сообщается в инсерционном мутанте OsHKT1; 4 . Этот мутант представляет собой вставку Т-ДНК в области выше первого кодона ATG, генерируя элементы в тандемном повторе с последовательностью ядра промотора 35S (Oda et al., 2018). Этот мутант, а также другие инсерционные мутанты, применяемые для функциональной геномики риса, могут быть получены в одном из наиболее важных источников инсерционных мутантов Т-ДНК, Базе данных функционального геномного экспресса риса (http://signal. salk.edu/cgi -bin / RiceGE).

Тем временем было сообщено об интригующей находке о вставках Т-ДНК в Arabidopsis . Трансформацию A. tumefaciens с использованием метода окунания цветов (чтобы избежать процессов in vitro ) сравнивали с генотипом дикого типа.Геном был повторно секвенирован с использованием Next Generation Sequencing (NGS), и были идентифицированы перестройки вставок Т-ДНК с небольшими мутациями, не коррелированными с конечным положением вставки (Schouten et al., 2017). Кроме того, как о малых, так и о больших делециях сообщалось конкретно в сайте вставки Т-ДНК, и был идентифицирован участок Т-ДНК без краевой последовательности (осколок Т-ДНК). Хотя фенотип ожидается, это не всегда происходит по двум причинам: во-первых, потому что неизвестно, где будет вставлена ​​Т-ДНК, и во-вторых, потому что могут произойти другие модификации (Schouten et al., 2017).

Недавно был опубликован надежный обзор вставок Т-ДНК в геном риса (Lo et al., 2016). Таким образом, мы укажем на самые последние открытия, которые дополняют современное состояние этого инструмента мутагенеза риса. С развитием биотехнологических методов, особенно в понимании культуры риса in vitro , были разработаны тысячи инсерционных мутантов. Сообщалось о развитии 100000 инсерционных мутантов риса с помощью векторов Т-ДНК, несущих репортерный GUS (β-глюкуронидаза) без промотора.Среди них мутантные линии со вставками в генах, кодирующих факторы транскрипции (Wei et al., 2017). Эти мутанты были применены для определения предпочтительного местоположения относительно действия фактора транскрипции и могут быть использованы для функционального анализа этих генов-кандидатов. За последние два года было описано несколько инсерционных линий, обеспечивающих функциональную идентификацию генов риса, вовлеченных во многие важные признаки (таблица 2).

Таблица 2 Биологические мутагены, применяемые для индукции случайных мутаций в рисе.

Транспозон и ретротранспозон Мутагенез

Активность ДНК-транспозона в Oryza sativa и Oryza glaberrima ответственна за увеличение количества мутаций во фланкирующих последовательностях транспозонов у этих видов (Wicker et al. , 2016). При вырезании и повторной вставке последовательностей, выполняемых транспозонами, репарация ДНК может вызвать до 10 раз больше мутаций, главным образом потому, что транспозоны предпочтительно вставляются в сайты, близкие к генам, что приводит к более высокой частоте мутаций в генных областях.Кроме того, аналогичные явления были выявлены в геномах кукурузы ( Zea mays ), ячменя ( Hordeum vulgare ) и пшеницы ( Triticum ssp.), Что выявило новый процесс, связанный с эволюцией генов у трав (Wicker et al. ., 2016).

Активность встраивания транспозонов широко применялась для получения крупномасштабных мутаций в геномах риса, как описано Wang и соавторами (2013), которые описали, что транспозоны, такие как miniature Ping ( mPing ), 607-pb и nDart1-3 использовали для развития мутантной линии риса.Кроме того, для получения инсерционных мутантов широко применялись два компонента системы транспозона кукурузы, Activator / Dissociation ( Ac / Ds ) и Enhancer / Suppressor Mutator ( En / Spm-dSpm ). в рисе (обзор Wang et al., 2013; Xuan et al., 2016). В присутствии Ac транспозазы элемент Ds имеет тенденцию к транспонированию и случайной интеграции в геном (McClintock, 1950). Переносную систему Ac / Ds применяли к рису для осуществления мутагенеза (Upadhyaya et al., 2006; Xuan et al., 2016). В сгенерированных популяциях более 70% мутантных линий показали Ds -независимых вставок. Вставка Ds в ген OsPS1-F ( Фотосистема 1-F субъединица ) вызвала потерю его функции, а OsPS1-F был охарактеризован как регулятор роста и развития растений посредством транспорта электронов (Ramamoorthy et al. ., 2018). Сообщалось, что автономный элемент Ac / Ds с высокой частотой транспонируется в соматических и зародышевых клетках риса (обзор в Kolesnik et al., 2004).

Вставка ретротранспозона может влиять на функцию гена, так как он преимущественно вставляется в генные, а не в межгенные области (Miyao et al., 2003). Следовательно, вставка ретротранспозона Tos17 в область выше OsHd1 (, дата заголовка 1 ), которая изменила время цветения риса (Hori et al., 2016). Tos17 (Hd1) показал позднее цветение в условиях короткого дня и преждевременное цветение в длинные дни, в отличие от соответствующего сорта Nipponbare дикого типа.

Мобильные элементы играли и продолжают играть важную роль в эволюции риса. Анализ подвижности ретротранспозонов в 3000 геномах риса показал, что подвиды indica , japonica и aus / boron происходят от диких родственников, которые давно разошлись, подтверждая гипотезу о том, что эти подвиды возникли в результате нескольких событий одомашнивания. . Эти результаты демонстрируют важность мобильных элементов в изменчивости и эволюции риса (Carpentier et al., 2019).

Целенаправленная мутация

Физические и химические мутагены вызывают случайные мутации, обеспечивая ограниченную частоту мутаций в желаемых / целевых локусах. С другой стороны, системы редактирования генома (мегануклеазы — MN; нуклеазы цинковых пальцев — ZFN; эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции — TALENS; сгруппированные с регулярными интервалами короткие палиндромные повторы — CRISPR) индуцируют целевые мутации и могут использоваться в качестве альтернативного мутагена ( Таблица 3).

Таблица 3 Мутагены, применяемые для индукции целевых мутаций в рисе.

Целевое редактирование генома опосредуется различными нуклеазами, которые вводят двухцепочечные разрывы ДНК (DSB). Они могут способствовать одинарным или двойным разрезам, стимулируя механизмы восстановления клеточной ДНК (обзор Zhu et al., 2017). Клетки представляют две разные системы репарации, гомологичную рекомбинацию (HR) и негомологичное соединение концов (NHEJ) (Bortesi and Fischer, 2015). В зависимости от используемой системы репарации будут получены различные модификации, способствующие генерации генетической изменчивости из DBS, индуцированной нуклеазами.

Восстановление двухцепочечных разрывов ДНК путем гомологичной рекомбинации

Во время мейоза Spo11-индуцированные двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) репарируются исключительно путем гомологичной рекомбинации (HR) с использованием аллельной хромосомной последовательности в качестве матрицы. Однако в соматических клетках HR действует реже, поскольку на его эффективность влияет наличие гомологичной последовательности. В этом случае можно использовать гомологичные последовательности, присутствующие в одной и той же хромосоме, в геноме или сестринской хроматиде после репликации (Puchta, 2005).

Систему ремонта HR можно разделить на консервативную и неконсервативную. В неконсервативных системах генетический материал теряется, тогда как в консервативных системах потерь не происходит. Одноцепочечный отжиг (SSA) является неконсервативным механизмом и зависит от проксимальной гомологичной последовательности. После появления DSB в обоих поврежденных сайтах происходит одинарная деградация (резекта), пока гомологичные последовательности не отожжены. Незавершенные одиночные нити разрушаются или промежутки заполняются, а затем соединяются нити (см. В Steinert et al., 2016).

Синтез-зависимый отжиг цепей (SDSA) и восстановление двухцепочечных разрывов (DSBR) являются консервативными механизмами. В целом, DSBR возникает в мейозе и может приводить к кроссинговеру между гомологичными хромосомами, тогда как SDSA работает в основном за счет восстановления DSB в соматических клетках. В SDSA после DSB гомологичная последовательность копируется в поврежденный сайт, и потери генетической информации не происходит. Точки останова ухудшаются, чтобы обнажить 3 ’конец одиночной нити. Одна из одинарных цепей с 3′-свободным концом вторгается в двухцепочечную гомологичную последовательность, будучи удлиненной на основе захваченной цепи матрицы.После этого удлиненная одиночная нить высвобождается и может быть повторно отожжена с гомологичной одиночной нитью (обзор в Steinert et al., 2016).

HR может происходить с использованием в качестве матрицы эндогенной ДНК (гомологичной DSB) или экзогенной последовательности, демонстрирующей области гомологии. В этом случае вместе с используемой системой редактирования в растение следует ввести плазмиду, содержащую донорскую ДНК или сам продукт ПЦР, соответствующий желаемой последовательности (Song and Stieger, 2017). Донорская ДНК должна иметь 5 ’и 3’ гомологичные границы по отношению к целевой ДНК, а также центральную область, содержащую последовательность, подлежащую редактированию (обмен нуклеотида) или последовательность, которую необходимо вставить.

Ремонт двухцепочечного разрыва ДНК с помощью негомологичного соединения концов

В большинстве геномов растений и животных механизм репарации HR встречается реже, чем механизм негомологичного соединения концов (NHEJ) (Bortesi and Fischer, 2015). В отличие от HR, NHEJ не требует гомологичной последовательности для репарации ДНК и, следовательно, подвержен ошибкам (Manova and Gruszka, 2015). Механизм NHEJ подразделяется на cNHEJ и aNHEJ. Механизм cNHEJ начинается с распознавания DSB гетеродимером Ku70 / Ku80, который образует кольцо, которое связывается на обоих концах и рекрутирует киназу ДНК-PKcs, предотвращая деградацию (Mannuss et al., 2012; Nishizawa-Yokoi et al., 2012; Manova, Gruszka, 2015), что приводит к минимальному изменению генетической информации (Puchta, Fauser, 2014). Поражение обрабатывается различными белками с целью восстановления, соответственно, фосфатных и гидроксильных групп на 5 ’и 3’ концах DSB и, наконец, связывания ДНК (Rulten et al., 2011; Manova and Gruszka, 2015).

При обработке aNHEJ происходит деградация последнего 3 ’конца. Отжиг двух одиночных цепей приводит к образованию соединений, в которых присутствует несколько комплементарных нуклеотидов.Как правило, концевые области обрезаются, происходит повторное соединение и обнажаются микрогомологии. Не исключено, что генетическая информация в месте соединения потеряна. В этом смысле процесс aNHEJ считается высоко мутагенным механизмом репарации (Puchta and Fauser, 2014; Manova and Gruszka, 2015). Следовательно, для целевой мутации можно ожидать восстановления NHEJ, когда редактирование направлено на молчание, но восстановление HR ожидается, когда целью является надлежащее редактирование (с помощью донора ДНК).

Мегануклеаза

Мегануклеаза (MN), также называемая хоминг-эндонуклеазой (HEases), представляет собой сайт-специфичные эндонуклеазы (они распознают и расщепляют длинные последовательности — от 14 до 40 п.н. — с высокой специфичностью).Этим можно управлять с помощью различных стратегий для увеличения количества целевых сайтов, что позволяет использовать его в качестве инструмента для редактирования генома (Arnould et al., 2011; Guha et al., 2017). MNs могут индуцировать DSB, которые будут репарироваться с помощью HR (с донорской ДНК) или NHEJ, процесс подверженный ошибкам из-за вставок или делеций в сайте расщепления (Arnould et al., 2011) (Figure 4A). Система MNs была эффективно использована на Arabidopsis , хлопке и кукурузе (обзор Weeks et al., 2016). Насколько нам известно, нет никаких исследований, применяющих MN в мутагенезе риса, однако эти исследования на Arabidopsis и других видах указывают на его потенциал в качестве инструмента для риса, нацеленного на целевую мутацию.

Рис. 4 Редактирование генома с использованием стратегий MN, ZFN, TALEN и CRISPR, которые приводят к двухцепочечному разрыву ДНК, который будет восстанавливаться путем гомологичной рекомбинации (HR) или негомологичного концевого соединения (NHEJ). HR требует введения плазмиды донорской ДНК или продукта ПЦР, соответствующего донорной ДНК. Для HR необходимо вставить донорскую ДНК вместе с системой редактирования. В этой гипотетической схеме будет отредактирован ген, связанный с урожаем семян риса. (A) Мегануклеаза (MN): ДНК-связывающий домен мегануклеаз сконструирован для распознавания конкретных целевых последовательностей. (B) Нуклеаза цинкового пальца (ZFN): факторы транскрипции цинкового пальца представляют мотив C2h3 с возможностью распознавания ДНК. Функция системы ZFN требует слияния мотивов ZF с рестриктазой Fok I . Fok I представляет ДНК-связывающий домен, который распознает последовательность 5-’GGATG-3 ’и домен неспецифического расщепления ДНК. Для системы нуклеазы цинкового пальца (ZFN) был сконструирован Fok I , и домен связывания ДНК был удален. В этом смысле домен неспецифического расщепления ДНК Fok I использовали для конструирования гибридной нуклеазы посредством связывания со связывающим доменом ZF. (C) Эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN): ДНК-связывающий домен TALE образован мономерами, каждый мономер распознает только один нуклеотид. Каждый мономер состоит из 34 аминокислот, которые повторяются в других мономерах, за исключением гипервариабельных аминокислот, расположенных в положениях 12 и 13 каждого мономера, которые являются детерминантами связывания с конкретным нуклеотидом. Эти аминокислоты известны как повторяющиеся вариабельные ди-остатки (RVD). Неспецифический домен расщепления ДНК Fok I использовали для конструирования гибридной нуклеазы посредством связывания с ДНК-связывающим доменом TALE, образуя систему TALEN. (D) Кластеры с регулярными интервалами коротких палиндромных повторов (CRISPR): В этой системе направляющая РНК (gRNA) (crRNA + tracrRNA) направляет рестрикционный фермент к определенной последовательности ДНК, которая будет расщепляться. Р — промотор; PMS, Выбор маркера растений; BMS, Выбор бактериальных маркеров; DBD, ДНК-связывающий домен. Введение плазмиды в растения риса можно осуществлять непосредственно методами электропорации и биобалистики или косвенно через Agrobacterium tumefaciens . В последнем случае необходимо добавить правую и левую границы в плазмиду, содержащую систему редактирования.

Нуклеазы цинковых пальцев

Нуклеазы цинковых пальцев (ZFN) представляют собой рестрикционные ферменты, генерируемые слиянием неспецифического домена расщепления ДНК ( Fok I ) с сайт-специфическими ДНК-связывающими белками цинковых пальцев (ZFP) (Kim et al. , 1996; Guo et al., 2010). Эндонуклеаза Fok I ( Flavobacterium okeanokoites ) показывает ДНК-связывающий N-концевой домен и С-концевой домен с неспецифической активностью расщепления ДНК. В этом смысле этот фермент можно сконструировать так, чтобы он расщеплял определенный сайт ДНК посредством связывания с другими доменами, которые распознают определенные последовательности (Kim et al., 1996). Модульная структура мотивов цинковых пальцев C ₂ H ₂ и их способность к независимому распознаванию делают эту структуру подходящей для разработки инженерных ZNP со специфичностью для новых последовательностей. Каждый мотив распознает 3 или 4 нуклеотида на α-спирали, и тандемные модификации ZF обеспечивают специфическое распознавание последовательностей ДНК (Liu et al., 1997; Beerli and Barbas, 2002; Guo et al., 2010). ZFN применяются при редактировании генома путем введения DSB в определенные участки геномной ДНК.Таким образом, гены-мишени могут быть прерваны мутагенезом, вызванным репарацией NHEJ, или модифицированы через HR, если предоставлена ​​гомологичная матрица ДНК (Guo et al., 2010) (Рисунок 4B).

ZFN считается эффективным средством редактирования генома и может использоваться в качестве новой технологии селекции риса для создания сортов (Cantos et al., 2014). Недавно, чтобы раскрыть функцию гена SSIVa ( Starch Synthase IVa ), ZFN, нацеленные на кодирующую область, были использованы для индукции DSB (Jung et al., 2018). Трансгенные растения представили преждевременные стоп-кодоны и события замены, что привело к инактивации гена SSIVa , низкому содержанию крахмала и карликовым фенотипам.

Активатороподобные эффекторные нуклеазы транскрипции

Эффекторные белки, подобные активатору транскрипции (TALE), встречаются в природе в составе фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas (обзор в Nemudryi et al., 2014). TALE содержит ДНК-связывающий домен, образованный мономерами из 34 повторяющихся аминокислот, каждый домен распознает уникальные пары оснований.Специфичность TALE определяется двумя гипервариабельными аминокислотами, расположенными в положении 12 ^-го и 13 ^-го мономера, которые известны как повторяющиеся вариабельные ди-остатки (RVD). Более того, TALE содержит ядерную локализацию сигнала и домен, который активирует транскрипцию генов-мишеней (обзор Nemudryi et al., 2014). RVD могут быть сконструированы для создания ДНК-связывающих белков, которые можно применять для редактирования генома определенного сайта. Независимая последовательность нуклеазы Fok I действует как нуклеазный сайт, специфичный для системы редактирования генома TALEN (слияние сконструированного массива повторов TALE с неспецифическим доменом эндонуклеазы FokI ), когда сайты-мишени распознаются различными TALE (обзор у Ма и Лю, 2015).

TALEN могут применяться для введения геномных DSB. Целевые DSB восстанавливаются NHEJ, что приводит к мутации путем вставки или удаления в поврежденном сайте. DSB также можно репарировать с помощью HR с помощью гомологичной донорской ДНК-матрицы, которая используется для введения единичных нуклеотидов или основных изменений вставки (Reyon et al., 2013) (Рисунок 4C). Сообщается, что в рисе TALEN вызывают большое количество наследственных мутаций, передаваемых от T1 к T2 в менделевских пропорциях. Кроме того, 81% мутаций затронули несколько оснований, что составляет 70% мутаций, вызванных делециями (Zhang et al., 2016). Аспекты, касающиеся мутаций, вызываемых TALEN в рисе, хорошо описаны (Zhu et al., 2017). В каллусе (T0) частота мутаций, о которых сообщалось, составляла 4-30%, что часто приводило к образованию химерных, гетерозиготных, биаллельных и в некоторых случаях гомозиготных растений. TALEN использовались для генерации мутаций во многих различных генах риса с целью улучшения таких характеристик, как промышленное качество, устойчивость к биотическому стрессу и устойчивость к абиотическому стрессу (Таблица 3).

Несмотря на то, что TALEN понимают трудоемкую технику построения мотива распознавания ДНК, опубликованные исследования показывают, что этот инструмент может быть применен непосредственно для улучшения риса.

Кластерный короткий палиндромный повтор с регулярными промежутками

Несомненно, большинство недавних исследований риса включают использование кластерной системы коротких палиндромных повторов с регулярными промежутками между промежутками (CRISPR), которая способствует более высокой частоте мутаций по сравнению с TALEN. Основные особенности мутаций, вызываемых CRISPR / Cas9 (CRISPR-ассоциированный белок) в рисе, хорошо описаны (Zhu et al., 2017). Частота мутаций, индуцированных системой CRISPR / Cas9 у риса, колебалась от 85% до 100%.Кроме того, при использовании специфической гРНК сообщалось о биаллельных мутантах в T0, представляющих до 100% мутаций, в то время как гомозиготные индивидуумы были получены с частотой до 50%. Одним из способов увеличения частоты гомозиготных мутаций является использование гРНК, нацеленных на один и тот же ген в разных регионах. В целом, мутации, индуцированные системами TALEN и CRISPR / Cas9 в рисе, обычно представляют собой вставки или делеции одной или сотен пар оснований, при этом сообщается только о 4% однонуклеотидных мутациях (Zhu et al., 2017).

Механизм CRISPR является частью адаптивной иммунной системы бактерий и архей против вторжения нуклеиновых кислот, таких как вирусы. Это достигается путем расщепления ДНК захватчика в определенных последовательностях. Иммунитет приобретается за счет вставки (спейсеров) ДНК захватчика между двумя соседними повторами на проксимальном конце локуса CRISPR. Когда происходит инвазия нуклеиновых кислот, локус CRISPR и спейсеры транскрибируются, они процессируются в небольшой мешающей РНК CRISPR (crRNA), которая комбинируется с трансактивирующей РНК CRISPR (tracrRNA) для активации нуклеазы Cas (ген, связанный с CRISPR), направленной на захватчик нуклеиновой кислоты.Этот механизм способен выполнять расщепление гомологичной последовательности ДНК захватчика (спейсера) (Barrangou et al., 2007, Bortesi and Fisher, 2015). Присутствие соседнего мотива протоспейсера (PAM), расположенного ниже ДНК захватчика, показывающего последовательность 5′-NGG-3 ‘или 5′-NAG-3’, является требованием для расщепления (Gasiunas et al., 2012, обзор в Bortesi и Фишер, 2015; рассмотрено в Zhu et al., 2017). NGG-PAM в изобилии присутствует в геномах растений, а рис представляет собой NGG-PAM каждые 9,8 п.н. (обзор в Zhu et al., 2017). Эта система позволила разработать новейшую инновационную технологию редактирования генома на основе сконструированных нуклеаз, управляемых РНК.Слияние crRNA с tracrRNA с образованием единой синтетической направляющей РНК (gRNA) упростило процесс (Jinek et al., 2012).

Процесс восстановления DSB является фундаментальным для эффективности системы CRISPR. Типы ремонта включают HR и NHEJ. В механизме репарации NHEJ вводятся небольшие делеции, но редко вставки. Мутации потери функции, приводящие к изменениям последовательности, вызывающим изменения в фазе считывания или изменения аминокислот, могут быть обнаружены в конечном продукте гена (обзор в Choudhary et al., 2017) (Рисунок 4D). При репарации DSB с помощью механизма HR донорская ДНК-матрица используется в качестве источника информации ДНК, которая копируется для сломанной хромосомы для восстановления ее целостности. Вариации донорской ДНК копируются HR в хромосоме. В этом случае необходимо ввести в организм-мишень Cas, gRNA, а также донорскую ДНК.

Crispr / Cas9

С системой CRISPR могут быть связаны разные нуклеазы. Систему CRISPR / Cas можно разделить на тип I, тип II и тип III в зависимости от присутствия белков Cas3, Cas9 и Cas10 соответственно (Макарова и др., 2011). Тип II — это наиболее широко используемая система редактирования генома (обзор Бортеси и Фишер, 2015). Система CRISPR типа II из Streptococcus pyogenes была адаптирована для индукции определенных DSB и редактирования генома в целевых областях. Самый простой и широко применяемый метод требует введения и экспрессии двух компонентов в организме-мишени: гена, кодирующего Cas9, и гРНК (crRNA + tracrRNA), гомологичной целевой последовательности. Cas9 может быть направлен на любую последовательность ДНК, специфичность которой определяется последовательностью гРНК, соответствующей целевой последовательности ДНК (Sander and Joung, 2014).Наиболее частыми мутациями, индуцируемыми Cas9 у риса, являются небольшие инделки (≤10 пн), часто одиночные нуклеотиды и вставки, которые в основном представляют собой пары оснований A / T (Zhu et al., 2017).

Необходимо отметить важные особенности, относящиеся к gRNA для системы CRISPR / Cas9. При разработке гРНК необходимо учитывать, что Cas9 допускает до трех несовпадений в области спаривания гРНК-ДНК, а несовпадения, близкие к мотиву NGG-PAM, значительно снижают сродство Cas9 к сайту-мишени. Таким образом, несоответствия допустимы только в дистальном положении протоспейсера.Из-за несоответствия между гРНК и целевым сайтом нецелевые (нецелевые) сайты более распространены в системе CRISPR / Cas9. Несоответствия в пределах первых 12 пар оснований рядом с PAM обычно сводят на нет расщепление ДНК в рисе, в то время как несовпадения менее 12 пар оснований в областях, близких к PAM, увеличивают вероятность нецелевых расщеплений в рисе. гРНК с высоким содержанием GC обеспечивают более высокую эффективность редактирования в рисе при использовании в системе CRISPR / Cas9. Подсчитано, что специфические гРНК могут быть сконструированы для 89,6% аннотированных транскриптов риса (Zhu et al., 2017).

Были идентифицированы некоторые параметры, которые влияют на частоту опосредованного CRISPR / Cas9 мутагенеза в каллусах риса (Mikami et al., 2015). Была обнаружена положительная корреляция относительно частоты мутаций экспрессии Cas9, увеличивающая период культивирования каллуса, экспрессирующего Cas9 и gRNA, наблюдается увеличение скорости мутировавших / немутантных клеток и разнообразия полученных мутаций. Тем не менее, двойные DSB могут быть индуцированы с целью удаления фрагментов. Для системы CRISPR / Cas9 делеции (200 п.н.) и большие делеции (357-761 п.н.) были получены с частотой 10% и 4-45% в растениях T0 из протопластов риса, соответственно (Zhu et al., 2017). Кроме того, делеции хромосомного сегмента (115-250Kb) были обнаружены с частотой от 16 до 25%.

Система CRISPR / Cas9 использовалась для мутагенизации генов риса для различных целей, в основном для важных сельскохозяйственных признаков (таблица 3). За последние несколько лет техника была улучшена. В этом смысле была разработана система множественного редактирования генов риса с использованием CRISPR / Cas9 (Wang et al., 2015). Эта мультиплексная система была получена, обеспечивая коэкспрессию белка Cas9 и многих гРНК, с возможностью одновременного редактирования разных генов.Мультиплексная система CRISPR / Cas9 применялась для редактирования четырех генов: OsGS3 ( Размер зерна 3 ), OsGW2 ( Ширина зерна 2 ), OsGW5 ( Ширина зерна 5 ) и OsTGW6 ( Вес 6 ), получая растения с более высокой массой зерна (Xu et al., 2016). Кроме того, CRISPR / Cas9 применялся для нацеливания на вставку Т-ДНК в геном риса (Lee et al., 2019a). Ранее считавшаяся случайной вставкой, в настоящее время эта технология была улучшена с помощью CRISPR / Cas9.

Crispr / Cpf1

Сообщалось, что новая система CRISPR из Prevotella и Francisella 1 (Cpf1 или Cas12a) эффективно производит направленный мутагенез риса и табака ( Nicotiana tabacum ) (Endo et al., 2016) . Ферменты Cpf1 принадлежат к семейству V нуклеаз CRISPR, которые включают как эндорибонуклеазную, так и эндодезоксирибонуклеазную активности, что способствует их использованию в процессе CRISPR-РНК (crRNAS) и при введении DSB в ДНК соответственно (обзор Begemann et al., 2017). Кроме того, было показано, что нуклеазы Cpf1 имеют низкие скорости редактирования вне мишени по сравнению с нуклеазами Cas9 (Begemann et al., 2017; Tang et al., 2018). Однако были идентифицированы нецелевые, связанные с активностью Cpf1 у риса из-за несоответствий в 11 ^th нуклеотидах от PAM, демонстрируя, что Cpf1 также допускает несовпадения (Endo et al., 2016).

Система состоит из новой направляющей РНК-эндонуклеазы с двумя разными характеристиками по сравнению с Cas9: Cpf1 использует мотив PAM, богатый тимином, в то время как Cas9 использует мотив PAM, богатый гуанином, таким образом, Cpf1 может применяться в качестве специфической последовательности нуклеаза для богатых мишеней AT.Кроме того, Cpf1 генерирует концы ДНК с 5 ’выступом, тогда как Cas9 создает тупые концы ДНК после расщепления. Также сообщалось, что crRNA и tracRNA необходимы для действия Cas9, однако Cpf1 нуждается только в 44-нуклеотидной crRNA, локализованной в 5’-направлении после повторяющейся последовательности и спейсера, чтобы управлять действием Cpf1 (Zetsche et al., 2015). Кроме того, сообщалось, что система CRISPR / Cpf1 выполняет редактирование и репрессию транскрипции в рисе (Tang et al., 2017). Что касается мультиплексных мишеней, то также сообщалось об исследовании с участием до четырех генов риса (Wang et al., 2017). Исследования с использованием Cpf1 из Fransicella novicida (FnCpf1) и Lachnospiraceae бактерии ND2006 (LbCpf1) показали, что Cpf1 эффективны при вставке ДНК посредством репарации HR при использовании вместе с crRNA и донором ДНК риса (Begemann et al., 2017 ). Сообщается, что частота мутаций, полученная для разных локусов у риса, достигает 47,2% (Endo et al., 2016). Кроме того, индуцированные мутации в основном были делециями, моноаллельными и биаллельными (Endo et al., 2016; Xu et al., 2017б). Разнообразные исследования демонстрируют применение системы CRISPR / Cpf1 в рисе, в основном, для аспектов развития и метаболизма растений (таблица 3).

Особенности системы CRISPR / Cas

Недавно программное обеспечение CRISPR-GE использовалось для дизайна гРНК, предсказания сайта-мишени, дизайна праймера для конструирования кассет экспрессии гРНК и амплификации сайта-мишени (Xie et al., 2017). Кроме того, он использовался для обнаружения мутантов на хроматограммах геномных ПЦР-ампликонов, содержащих целевые сайты, и для загрузки геномных последовательностей из эталонных геномов растений и других организмов.Кроме того, он подходит для выбора подходящего целевого сайта для нуклеаз Cas9 или Cpf1.

Одна из проблем редактирования через CRISPR — это нецелевые. В этом смысле CRISPR-GE помогает снизить вероятность нецелевого редактирования, поскольку он позволяет выбирать высокоспецифичные гРНК. Другой способ уменьшить вероятность попадания в цель — это использование Cas9 из различных микроорганизмов, которые распознают более крупные последовательности PAM. Важно отметить, что Tang et al. (2018) выявили отклонения от цели, связанные с активностью Cas9 в рисе T0, в то время как отклонения от цели не были связаны с активностью Cpf1.Однако у растений T1 не было выявлено нецелевых, не относящихся ни к Cas9, ни к Cpf1. Эти данные важны и демонстрируют возможность использования Cas9 и Cpf1 в определенных селекционных приложениях для нескольких поколений (Tang et al., 2018). Нецелевые объекты не всегда являются проблемой, исследователи использовали отклонения от цели как способ редактировать более одного гена с помощью только одной гРНК (Endo et al., 2015).

Из-за различий в влиянии мутаций, вызванных одной и той же системой редактирования на гены риса, были предложены факторы, влияющие на репарацию DSB, которая определяется некоторыми генными чертами, независимо от используемой нуклеазы (Zhu et al., 2017). В целом, эти наблюдения демонстрируют сложность методов мутагенеза и открывают путь к дальнейшему пониманию функций генов и развитию превосходных растений риса.

Методы обнаружения мутаций

Для риса было применено и разработано множество различных методов обнаружения мутаций (таблица 4). TILLING (нацеливание на индуцированные локальные поражения в геномах) — один из наиболее широко используемых методов в обратной генетике для обнаружения точечных мутаций (рис. 5).Во-первых, был разработан метод обнаружения точечных мутаций, вызванных химическими мутагенами (McCallum et al., 2000). Однако его использовали в мутантных популяциях риса, созданных с помощью EMS (Till et al., 2007; Serrat et al., 2014), MNU (Suzuki et al., 2008), комбинации MNU и SA (Till et al., 2007) и γ-квантов (Cho et al., 2010; Chun et al., 2012). Кроме того, он использовался в полиплоидных организмах, таких как пшеница (Sestili et al., 2010) и аутотетраплоидный арабидопсис (Tsai et al., 2013), что позволяет также применять его при полиплоидии риса.TILLING by sequence — это приложение секвенирования нового поколения (NGS) и биоинформатики в мутантных популяциях (Kumar et al., 2017). TILLING по последовательности применяли в популяциях мутантов риса, полученных с помощью обработки MNU и SA (Tsai et al., 2011; Kim and Tai, 2014). TILLING-плавление с высоким разрешением (HRM) обнаруживает мутации в генах-мишенях с помощью ПЦР, процесса, контролируемого ДНК-связывающим красителем. При ренатурации двухцепочечной ДНК флуоресценция увеличивается, что приводит к кривой плавления (см. Обзор Taheri et al., 2017). В рисе TILLING-HRM применяли для обнаружения изменений ДНК, вызванных γ-лучами (Li et al., 2018b). Поскольку генерация мутаций экзона весьма интересна для функциональных исследований генов, метод, использующий захват экзома, связанный с NGS, был применен в популяции рисовой TILLING, полученной обработкой EMS (Henry et al., 2014). С помощью EcoTILLING были идентифицированы естественные вариации генома риса (Vaughn and Bennetzen, 2013). EcoTILLING также является методом обратной генетики и применяет те же принципы TILLING, но в естественных популяциях, а не в индуцированных популяциях мутантов (обзор Barkley and Wang, 2008).Eco-TILLING по последовательности был использован для идентификации полиморфизмов в генах, кодирующих синтазы крахмала, потенциально связанных с увеличением резистентного крахмала и снижением индекса гидролиза (Raja et al., 2017).

Таблица 4 Методы обнаружения мутаций, применяемые в рисе.

Рис. 5 Обнаружение мутации методом TILLING (Till et al., 2003). ДНК дикого типа и мутантные ДНК подвергают полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфичных для генов праймеров.Амплифицированная ДНК объединяется в одной пробирке с амплифицированной мутантной ДНК и амплифицированной ДНК дикого типа. Во вторую пробирку дважды добавляют ДНК дикого типа. Обе пробирки подвергаются циклам денатурации и ренатурации, образуя, в случае мутанта, гетеродуплекс, гибридный двухцепочечный с мутантной цепью и цепью дикого типа, а в случае дикого типа образуется гомодуплекс с диким типом. -типа двухцепочечной ДНК. После обработки эндонуклеазой ( CEL I ) обеих ДНК (гибридной и негибридной) нуклеаза может найти и распознать пары несовпадений в гибридной ДНК и расщепить двухцепочечную ДНК.Обе ДНК подвергаются электрофорезу с использованием молекулярного маркера (MM), гетеродуплекса (Ht), расщепленного эндонуклеазой, и непереваренного гомодуплекса (Hm).

MutMap (Abe et al. (2012) возник на основе мультигенного контроля большинства агрономических признаков. Он позволяет быстро идентифицировать причинные нуклеотидные изменения с помощью полногеномного ресеквенирования объединенной ДНК мутантного потомства F ₂ , полученного в результате скрещивания между мутантами-кандидатами и родительской линией, как правило, с использованием маркеров SNP (рис. 6).Мутантные локусы, ответственные за карликовый фенотип и бледные листья, были идентифицированы с помощью MutMap. Метод MutMap-Gap, также предложенный для риса, является альтернативой, когда существует большая разница между эталонным геномом и мутантом для данной области (Takagi et al., 2013) (Рисунок 6). В MutMap + (Fekih et al., 2013) нет необходимости в искусственных скрещиваниях между мутантными растениями риса и растениями дикого типа, причинные мутации идентифицируются путем сравнения частот SNP объемных образцов ДНК мутантного и дикого потомства M _{3. Поколение} произошло от самоопыления гетерозиготной особи M ₂ (рис. 6).

Рис. 6. Методы MutMap (Abe et al., 2012), MutMap Gap (Takagi et al., 2013) и MutMap + (Fekih et al., 2013). MutMap был разработан для выявления мутаций с полиморфным одиночным нуклеотидом (SNP) между мутантным генотипом и генотипом дикого типа. Оба растения скрещиваются, и поколение F ₁ самоопыляется (⊗). ДНК экстрагируют из F ₂ дикого типа и мутанта для выполнения секвенирования ДНК с последующим картированием SNP для поиска мутаций, связанных с фенотипом.MutMap Gap был разработан, когда нет доступной последовательности желаемого генотипа для мутации. Желаемый генотип (WT-X) секвенируется и выравнивается с эталонным геномом (секвенированный генотип), и полиморфные SNP обнаруживаются и изменяются между WT-X и эталонным геномом для получения желаемого эталонного генома. После следования MutMap. MutMap + был разработан, чтобы избежать скрещивания между генотипами дикого типа и мутантными генотипами. Гетерозиготные растения в поколении M ₁ и M ₂ являются самоопыляемыми (), а гомозиготные растения M ₃ подвергают секвенированию ДНК для картирования SNP.После этого выполняется выравнивание с эталонным геномом для выявления полиморфных SNP, связанных с фенотипом.

Стратегия идентификации отредактированного генома риса была предложена Lu et al. (2017). CRISPR-S включает включение РНКи в вектор CRISPR / Cas9, таким образом, присутствие и активность Т-ДНК на трансгенных растениях можно контролировать на основе РНКи. Также сообщалось о двух новых методах идентификации мутаций, индуцированных CRISPR / Cas9 риса (Biswas et al., 2019). Во-первых, в методе, основанном на ПЦР, мишени амплифицируются с использованием двух пар праймеров для каждого целевого локуса и визуализируются с помощью гель-электрофореза. Во втором методе, основанном на маркировке ампликонов, мишени амплифицируются с использованием трипраймеров (один из которых является универсальным 5′-меченным 6-FAM) и обнаруживается с помощью капиллярного электрофореза ДНК (Biswas et al., 2019). Кроме того, было разработано несколько баз данных для идентификации мутантов как для химического, так и для физического мутагенеза, а также для инсерционных мутантов.Сообщалось о надежных списках баз данных (Wei et al., 2013; Yang et al., 2013).

Успешное прямое применение мутантов в сельском хозяйстве

Перспективы синтетической биологии

Помимо применения в функциональной геномике, вставка Т-ДНК имеет прямое применение при разработке новых генотипов, таких как золотой рис. Во-первых, золотой рис был разработан путем введения Т-ДНК, состоящей из генов фитоинсинтазы и ликопенциклазы (из Narcissus pseudonarcissus ) и десатуразы каротина (из Erwinia uredovora carotera ) синтез, предшественник витамина А (Ye et al., 2000). Впоследствии, с развитием функциональных геномных исследований, Золотой рис 2 был разработан путем вставки Т-ДНК, содержащей фитоенсинтазы (из Zea mays ) и десатуразы каротина (из Erwinia uredovora ) (Paine et al. др., 2005). Золотой рис 2 накапливает больше каротиноидов по сравнению с золотым рисом, который является более многообещающим источником витамина А. Развитие золотого риса может иметь большое влияние на смягчение проблемы дефицита витамина А, хотя он был выпущен только в некоторых странах, таких как Австралия, Канада. , Новая Зеландия и США (ISAAA, 2019).Помимо золотого риса, другие генотипы риса были разработаны путем введения Т-ДНК и уже были выпущены в некоторых странах, что оказало положительное влияние на сельское хозяйство (ISAAA, 2019).

Сорта риса, устойчивые к имидазолиноновым гербицидам

Сорный красный рис — одна из основных проблем на посевных площадях риса, снижение урожайности зерна, увеличение производственных затрат и обесценивание собранного урожая. Сорный красный рис и культурный рис относятся к одному виду ( Oryza sativa L.), поэтому селективные гербициды, применяемые для борьбы с инвазивными растениями, неэффективны при удалении красного риса. В 2002 году Сельскохозяйственный центр Университета штата Луизиана (LSU AgCenter) разработал коммерческие генотипы CL 121 и CL 141, устойчивые к имидазолинону (IMI-рис). Эти генотипы были разработаны из мутантной линии 93-AS3510, полученной с помощью EMS. После, используя аналогичные подходы, был разработан PWC16, из которого произошел CL 161, высокопродуктивный генотип.Генотип PUITA INTA CL был разработан в Аргентине с использованием генетического фона, отличного от того, который был получен в США, но также возник в результате искусственной мутации (обзор Sudianto et al., 2013).

Генотипы риса IMI демонстрируют точечную мутацию в гене, который кодирует фермент ацетолактатсинтазу или ALS, также известный как синтаза ацетогидроксикислоты или AHAS. БАС отвечает за биосинтез аминокислот с разветвленной цепью (валин, лейцин и изолейцин). Гербициды IMI не действуют как конкурентные ингибиторы фермента ALS и предотвращают выработку аминокислот, убивая растения из-за их неспособности синтезировать белки.Первая мутантная линия, 93-AS3510, показала замену кодона GGG на GAG в положении 654 (домен E ALS), что привело к замене аминокислоты с глицина на глутаминовую кислоту (gly654glu). Во второй мутантной линии, PWC16, кодон AGT был заменен на AAT в положении 653 (домен E ALS), заменив серин на аспарагин (ser653asn). В генотипе PUITA INTA CL были идентифицированы изменения в C-домене ALS, вызывающие преобразование GCG в ACG в положении 122, приводящие к переключению аланина на треонин (ala122thr) (Roso et al., 2010). Мутации ALS gly654glu, ser653asn и ala122thr делают фермент нечувствительным к IMI, что приводит к устойчивости риса к гербицидам (обзор в Sudianto et al., 2013).

На основе первых полученных мутантов новые генотипы риса IMI были разработаны во многих разных странах. Помимо США, генотипы риса IMI выращивают в Северной Америке, Никарагуа, Панаме, Колумбии, Бразилии, Коста-Рике, Уругвае, Аргентине, Парагвае, Боливии, Доминиканской Республике и Гондурасе. Кроме того, он культивируется в Малайзии и Италии (обзор Sudianto et al., 2013; рассмотрено в Merotto et al., 2016). В США и Бразилии рис IMI обрабатывается более чем 700 000 и 600 000 га соответственно. В Уругвае и Аргентине рис IMI занимает посевные площади в 70 000 га и 32 000 га соответственно. Малайзия и Италия обрабатывают 95 000 и 60 000 га соответственно (обзор Sudianto et al., 2013).

Рис IMI стал важным событием в цепочке производства риса, учитывая потери, вызванные появлением красного риса. Рис IMI демонстрирует эффективность индукции мутации в качестве инструмента селекции, даже если это случайная мутация, которая потребовала много времени и труда для получения желаемого изменения в интересующем гене.

Заключение и перспективы на будущее

История индукции мутации началась очень давно. Однако с самого начала и до настоящего времени было выполнено много улучшений, чтобы увеличить частоту мутаций. Рис является одним из основных видов сельскохозяйственных культур, и, поскольку он имеет небольшой геном и проявляет синтению с другими культурами, многие достижения в структурной и функциональной геномике риса были распространены на другие виды сельскохозяйственных культур. Рис уже был моделью с тех пор, как были получены первые результаты индукции мутации, и это включает более 90 лет исследований (рис. 7).Многое было достигнуто в агрономии за счет увеличения изменчивости риса. Функциональная характеристика генов, создание новых сортов из мутантов и даже генно-инженерные мутантные генотипы, несущие несколько вставок последовательностей ДНК, были получены посредством мутагенеза. В настоящее время можно применять более продвинутые инструменты, такие как CRISPR / Cas, для дальнейшего улучшения риса и других видов. Ценные исследования, проведенные учеными по всему миру, способствовали развитию науки и сельского хозяйства, и каждый день сообщается о новых разработках, касающихся механизмов индукции мутаций.Кроме того, открытие генетических механизмов восстановления повреждений ДНК помогло увеличить количество мутаций в рисе. Это демонстрирует, что увеличение генетической изменчивости является одной из целей молекулярных исследований, как для функциональных открытий, так и для манипулирования важными агрономическими признаками. Однако остается вопрос: создали ли мы уже достаточно генетической изменчивости для создания супер-риса? Безусловно, исследования и разработка новых технологий будут продолжать появляться, способствуя применению индукции мутаций для развития превосходного генотипа риса.

Рисунок 7 История индукции мутации в рисе. Новаторское исследование Штадлера по индукции мутации с помощью рентгеновских лучей в ячмене, кукурузе и пшенице (Stadler, 1928; Stadler 1930) продемонстрировало возможность создания генетической изменчивости посредством мутагенеза. Это начало новую эру, когда это средство можно было применять на самых разных организмах. Создание первого мутанта риса в Китае в 1957 году (ISAAA, 2019) знаменует собой одну из важных вех в истории мутаций риса.В США (1977 г.) был одобрен первый коммерческий мутантный сорт риса (Rutger et al., 1977). После этого также сообщалось о вставке и экспрессии Т-ДНК в рисе (Raineri et al., 1990). В 1993 г. в геном риса был вставлен автономный элемент Ac , компонент системы транспозонов кукурузы (Shimamoto et al., 1993). В 1996 году сообщалось об использовании ретротранспозонов для индукции мутаций в рисе (Hirochika et al., 1996). В 2002 году в США был разработан один из мутантов риса, который произвел революцию в сельском хозяйстве.Устойчивые к имидазолиноновым гербицидам сорта риса используются для борьбы с инвазивным красным рисом (обзор в Sudianto et al., 2013). В 2002 г. впервые появились черновые варианты последовательностей генома japonica Nipponbare (Goff et al., 2002) и indica 9311 (Yu et al., 2002). В 2005 году была опубликована основанная на карте полная последовательность генома риса, ставшая золотым стандартом геномов сельскохозяйственных культур (IRGSP, 2005). В последнее время технологии редактирования генома широко используются у различных организмов, включая растения.Первые методы, применяемые к мутагенезу риса, использовали неспецифическую нуклеазу ( Fok I ), связанную с ДНК-специфическим доменом, охватывающую TALEN (транскрипционно-подобные эффекторные нуклеазы) (Li et al., 2012; Shan et al., 2013) и ZFN (нуклеазы цинковых пальцев) (Cantos et al., 2014; Jung et al., 2018). Система CRISPR / Cas широко используется для стимулирования целевого редактирования генома и применяется в рисе с 2013 года (Shan et al., 2013; Jiang et al., 2013, Miao et al., 2013; Feng et al., 2013; Shan et al., 2014). В настоящее время, согласно отчетам ФАО / МАГАТЭ, с момента появления первого генотипа, разработанного в Китае в 1957 году, было официально зарегистрировано 823 мутанта риса.

В любом будущем сценарии селекционеры риса всегда будут иметь определенную цель — увеличение урожайности для обеспечения продовольственной безопасности. постоянно растущего населения. В связи с этим существует спрос на разумные сорта сельскохозяйственных культур, устойчивые к неблагоприятным условиям окружающей среды на планете, меняющей климат. Тем не менее, предпринимаются усилия по повышению качества риса, внешнего вида зерна, помольных свойств, вкусовых и кулинарных качеств, сенсорного и пищевого состава, чтобы обеспечить приемлемость для потребителей и фермеров, а также удовлетворить спрос на витамины и минералы среди населения, где рис является основным. источник пищи.Основываясь на исследованиях, обсуждаемых здесь, можно проверить, что мутагенез является ключевым инструментом в развитии генетических ресурсов, которые являются новыми источниками изменчивости для развития сортов, чтобы преодолеть будущие потребности (Рисунок 8). Таким образом, различные агенты мутагенеза (целевые или случайные) можно считать революционными инструментами в селекции растений. Наша эффективность разведения повысилась благодаря лучшим геномным ресурсам и другим достижениям в молекулярной генетике, клеточной биологии и методах фенотипирования.Принимая во внимание эти аспекты, мутагенез имел, имеет и, безусловно, будет иметь влияние на генетику и селекцию риса.

Рис. 8 Стратегии создания изменчивости риса. Усовершенствованные сорта должны соответствовать требованиям, т. Е. Быть адаптированными к условиям выращивания и удовлетворять вкусы потребителей. При длительном отборе по желаемым признакам генетическая изменчивость снижается, а генотипы уменьшают свою ценность из-за адаптации (т. Е. Изменения окружающей среды) или потребительского вкуса (т.е., потребители меняют свои привычки) потери. Чтобы преодолеть эту проблему, применяются стратегии случайных или целевых мутаций для увеличения вариаций генома риса, создавая новые популяции с различными признаками, которые могут быть выбраны в соответствии с целями селекционера. При этом цель состоит в том, чтобы производить супер-рис, отвечающий экологическим и рыночным требованиям.

Вклад авторов

AC разработал первоначальную концепцию и схему. VE, CP и CB улучшили предложение и рукопись.VE, CP, CB и AC редактировали рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Финансирование

Исследование проводилось при финансовой поддержке Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) и Conselho Nívional esencónícó de Desencónícó ).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим доктора Перри Густафсона за плодотворные обсуждения этой темы.

Ссылки

Абэ, А., Косуги, С., Йошида, К., Нацуме, С., Такаги, Х., Канзаки, Х. и др. (2012). Секвенирование генома выявляет агрономически важные локусы риса с помощью MutMap. Нац. Biotechnol. 30, 174–178. doi: 10.1038 / nbt.2095

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Abe, T., Matsuyama, T., Sekido, S., Ямагути, И., Йошида, С., Камея, Т. (2002). Мутанты риса с дефицитом хлорофилла продемонстрировали делецию фрагмента ДНК при облучении тяжелыми ионами. J. Radiat. Res. 43, S157 – S161. doi: 10.1269 / jrr.43.S157

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Akter, M. B., Piao, R., Kim, B., Lee, Y., Koh, E., Koh, H.-J. (2014). Точное картирование и анализ гена-кандидата нового мутантного гена апикального аборта метелки у риса. Euphytica 197, 387–398.doi: 10.1007 / s10681-014-1074-8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Almadanim, M.C., Alexandre, B.M., Rosa, M.T.G., Sapeta, H., Leitão, A.E., Ramalho, J.C., et al. (2017). Кальций-зависимая протеинкиназа риса OsCPK17 нацелена на внутренний белок плазматической мембраны и сахарозо-фосфатсинтазу и необходима для правильной реакции на холодовой стресс. Завод. Cell Environ. 40, 1197–1213. doi: 10.1111 / pce.12916

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Алеманно, Л., Guiderdoni, E. (1994). Повышенная вдвое гаплоидная регенерация растений из пыльников риса ( Oryza sativa L.), выращенных на средах с добавлением колхицина. Plant Cell Rep. 13, 432–436. doi: 10.1007 / BF00231961

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Arnould, S., Delenda, C., Grizot, S., Desseaux, C., Pâques, F., Silva, G.H., et al. (2011). Мегануклеаза I-CreI и ее модифицированные производные: приложения от модификации клеток до генной терапии. Protein Eng. Des. Sel. 1-2, 27–31. doi: 10.1093 / протеин / gzq083

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баркли, Н., Ван, М. (2008). Применение TILLING и EcoTILLING в качестве обратных генетических подходов для выяснения функции генов у растений и животных. Curr. Геном. 9, 212–226. doi: 10.2174 / 138920208784533656

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Barman, H. N., Sheng, Z., Fiaz, S., Zhong, M., Wu, Y., Cai, Y., et al.(2019). Создание новой термочувствительной генной линии риса с мужской стерильностью путем направленного мутагенеза гена TMS5 с помощью системы CRISPR / Cas9. BMC Plant Biol. 19, 109. doi: 10.1186 / s12870-019-1715-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., et al. (2007). CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость к вирусам у прокариот. Наука. 315, 1709–1712. DOI: 10.1126 / science.1138140

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барт, Р. С., Черн, М., Вега-Санчес, М. Э., Канлас, П., Рональд, П. К. (2010). Рис Snl6, член семейства генов, подобных циннамоил-КоА-редуктазе, необходим для Nh2-опосредованного иммунитета к xanthomonas oryzae pv. oryzae. PLoS Genet. 6, e1001123. doi: 10.1371 / journal.pgen.1001123

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Basu, D., Majhi, B. B., Sripriya, R., Велутхамби, К. (2017). Вставка Т-ДНК Agrobacterium в ген DWARF SHOOT AND DEFECTIVE PANICLE1 (DSDP1) риса вызывает тяжелый карликовый фенотип, снижает жизнеспособность растений и влияет на прорастание семян. J. Plant Biochem. Biotechnol. 26, 395–405. doi: 10.1007 / s13562-017-0400-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Берли Р. Р., Барбас К. Ф. (2002). Инженерные факторы транскрипции полидактильных цинковых пальцев. Нац. Biotechnol. 20, 135–141. DOI: 10.1038 / nbt0202-135

PubMed Abstrac

Как приготовить идеальный рис для суши дома