ИНВЕСТИЦИОННЫЙ ПОРТАЛ ВОЛГОГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ

Совет Центрального банка состоит из Председателя Центрального банка, двух его заместителей, пяти членов Совета. Пятерых членов Совета Центрального банка выбирает Национальное Собрание Республики Армения сроком  на шесть лет. Члены Совета Центрального банка не могут занимать другие должности в Центральном банке.

 

Высшим должностным лицом Центрального банка является Председатель Центрального банка. Председателя Центрального банка выбирает Национальное Собрание Республики Армения на шесть лет.

 

Председатель Центрального банка координирует естественную деятельность Центрального банка, представляет Центральный банк в Республике Армения, иностранных государствах и международных организациях, осуществляет иные полномочия, не внесенные законом в компетенцию Совета Центрального банка.

 

В случае отсутствия Председателя Центрального банка или невозможности исполнения им своих долж­ностных обязанностей его замещает один из заместителей Председателя Центрального банка, а в случае отсутствия заме­стителей или невозможности исполнения ими своих должностных обязанностей – старший по возрасту член Со­вета Центрального банка.

 

Заместителей Председателя Центрального банка выбирает Национальное Собрание Республики Армения сроком  на шесть лет.

 

Председатель Центрального банка, его заместители и другие члены Совета Центрального банка во время исполнения своих должностных обязанностей не могут занимать иную не обусловленную их статусом должность в государственных органах или органах местного самоуправления, быть членами какой-либо партии, или иным образом заниматься политической деятельностью, заниматься предпринимательской деятельностью, или выполнять иную оплачиваемую работу, кроме научной, педагогической и творческой работы. В своих публичных выступлениях они должны проявлять политическую сдержанность. Члены Совета Центрального банка, Председатель, заместители Председателя Центрального банка вправе занимать обусловленные их статусом должности в коммерческих  организациях и фондах.

 

Критерием систем управления центральными банками является степень независимости центральных банков, которая главным образом относится к независимости в осуществлении денежно-кредитной политики.

 

В 2013 году Центральному банку Республики Армения присуждены индекс независимости Кукиермана и индекс GMT.

ЦБ начал публиковать список компаний с признаками нелегальной деятельности

Банк России будет вести публичный список организаций и интернет-проектов, в деятельности которых регулятор выявил признаки финансовой пирамиды, нелегального кредитора или профессионального участника рынка ценных бумаг. Эксперты считают, что этот реестр может пригодиться гражданам, а также поисковикам, сервисам по поиску работы и многим другим площадкам в борьбе с мошенниками.

В черный список Банка России уже включено более 1,8 тыс. организаций и проектов: это нелегальные кредиторы, работающие без лицензии, псевдоброкеры и нелегальные форекс-дилеры, а также финансовые пирамиды. Их будут вносить в реестр еще до того, как деятельность таких компаний будет признана незаконной (но уже после сбора доказательств), чтобы уменьшить ущерб от их деятельности. ЦБ рассчитывает, что это защитит россиян от мошенников.

«Мы надеемся, что предание огласке имен таких организаций поможет потребителям избежать риска быть обманутыми и будет способствовать скорейшему очищению рынка от нелегальных игроков», — заявил заместитель председателя Банка России Сергей Швецов.

ЦБ просит граждан передавать регулятору и в правоохранительные органы информацию о таких компаниях. Банк России будет обновлять черный список каждые десять дней.

Эксперты считают, что этот реестр можно использовать с большим позитивным эффектом, если к этому подключатся поисковики и различные интернет-сервисы.

«Идея неплохая, потому что она позволяет пользователям, потенциальным контрагентам, как физлицам, так и юрлицам, узнавать дополнительные подробности об организации. Эти данные могут быть встроены в различные цифровые сервисы, в т.ч. поисковые, при соответствующей интеграции, или в сервисы по подбору услуг и предложений, т.е. теоретически выхлоп может быть очень позитивный», — пояснил «Газете.Ru» координатор Центра безопасного Интернета Урван Парфентьев.

Это позволит вычислить и откровенных мошенников, которые работают под видом организаций, которые, например, формально прекратили деятельность, добавил он.

«Яндекс постоянно мониторит списки ЦБ, и уже использует их для верификации официального статуса финансовых организаций, — рассказали «Газете.Ru» в пресс-службе компании.

«Я будто в тумане»: как люди описывают столкновение с черными брокерами

Некоторые из мошенников используют сервисы по поиску работы для привлечения ничего не подозревающих людей в свои сети. Как описывают столкнувшиеся с «черными брокерами» люди их схему, все начинается со звонка от «потенциального работодателя». Сначала соискателя зовут на вакансию, связанную, например, с документооборотом, обещают приличную оплату.

«Но чтобы приступить к работе, нужно пройти обучение. Ты приходишь к ним в офис. Они рассказывают про финансы, экономику и инвестиции. Для новичка интересно. На третий день начинается «практика». Ты заходишь в трейдерскую программу, изучаешь графики, схемы. Показывают, как открыть продажу, получить прибыль. Ты в демо-версии начинаешь тренироваться. Все якобы ради «отчетов» для клиентов. Дело заканчивается тем, что ты уже сам участник продаж. Вкладываешь деньги. Теряешь, вкладываешь еще. До тех пор, пока из тебя не высосут последнее», — описывает схему М., которой удалось распознать обман почти сразу и сбежать.

Как говорят пострадавшие, вокруг них создают атмосферу «идеально срежессированного спектакля»: «чистенький офис, приглаженные молодые юноши в галстучках, пиджачках, накрахмаленных рубашечках. Цокают на каблучках молоденькие секретарши и работники hr. Предлагают чай, кофе и даже вино. Куча народу! Все заняты, деловые, курс валют по телефону обсуждают».

А для «одурманивания» жертв применяют отработанные психологические схемы, так что люди, как правило, начинают задавать неудобные мошенникам вопросы уже после того, как потратили время или отдали деньги. «У меня было ощущение, что я под гипнозом. Можно же было с первого раза включить логику!», сокрушается М. Она позже нашла своего «работодателя» в интернете, где узнала, что они — группа профессиональных психологов, «черных брокеров».

Другие пользователи, поделившиеся схожими историями из Москвы, Калининграда и других городов, утверждают, что проверяли компании в сети и через приложения и сервисы, но ничего не нашли: «Моя аналогичная контора не пробивалась ни через GetContact, ни Яндекс, ни Google, ни «За честный бизнес»», говорит О. Возможно, черный список от Банка России станет еще одним — и более эффективным инструментом.

Отличить таких мошенников от реальных специалистов по подбору персонала можно по 3 признакам, которые должны насторожить соискателя: у кандидата на должность просят оплаты — под любыми предлогами, включая «обучение»; соискателя после первого звонка просят предоставить его личные данные, включая номер паспорта; специалист по подбору персонала гарантирует соискателю, что его примут на работу — добросовестные HR никогда не могут гарантировать прием на работу, — говорит СЕО рекрутингового агентства PROTALENT lab Елена Богомолова.

А теперь можно будет проверить работодателя и по черному списку ЦБ — или пожаловаться на мошенников напрямую Банку России.

Оформление лицензии на брокерскую деятельность (брокерская лицензия), лицензия на доверительное управление, дилерская лицензия | Юридическая фирма Jus Privatum

Лицензирование деятельности профессиональных участников рынка ценных бумаг. Брокерская лицензия

О лицензировании брокерской, дилерской деятельности и деятельности по управлению ценными бумагами

Предлагаем Вашему вниманию услуги компании Jus Privatum по лицензированию брокерской, дилерской, депозитарной деятельности и деятельности по управлению ценными бумагами с учетом вступления в силу с 15.09.2015 г. новых лицензионных требований и условий осуществления  профессиональной деятельности на рынке ценных бумаг.

В настоящее время лицензия выдается отдельно на каждый вид профессиональной деятельности на рынке ценных бумаг.

При этом брокер в зависимости от сделок и операций, совершаемых при осуществлении брокерской деятельности, может получить одну из следующих лицензий:

• Лицензия на осуществление брокерской деятельности.
• Лицензия на осуществление брокерской деятельности только по заключению договоров, являющихся производными финансовыми инструментами, базисным активом которых является товар.
• Лицензия профессионального участника рынка ценных бумаг на осуществление брокерской деятельности, не имеющего права на основании договора на брокерское обслуживание с клиентом использовать в своих интересах денежные средства клиентов и совершать сделки с ценными бумагами и производными финансовыми инструментами за счет клиентов без привлечения другого брокера (агента), являющегося участником торгов и участником клиринга (лицензия клиентского брокера).

 

Общие лицензионные требования по новому порядку лицензирования

С 15.09.2015 г. с вступлением в силу Положения Банка России от 27 июля 2015 г. N 481-П:

1. Наличие собственных средств в размере, установленном Банком России (Положение Банка России от 19 июля 2016 г. N 548-П):

1.1. Размер собственных средств определяется как разница между стоимостью активов и суммой пассивов.

1.2. Стоимость активов и сумма пассивов определяются на дату расчета собственных средств на основании данных бухгалтерского учета.

1.3. К расчету собственных средств принимаются следующие активы:

• Недвижимое имущество, транспортные средства, вычислительная техника, принятые организацией к бухгалтерскому учету в качестве основных средств.
• Объекты незавершенного строительства в части затрат на приобретение земельных участков и строительство объектов основных средств.
• Программы для ЭВМ, базы данных и затраты на их приобретение.
• Дебиторская задолженность.
• Ценные бумаги.
• Отдельные виды финансовых вложений.
• Денежные средства организации.

2. Наличие единоличного исполнительного органа (далее – ЕИО) и как минимум одного контролера или руководителя службы внутреннего контроля (далее совместно – контролер) (основное место работы)
3. Соответствие органов управления, работников, учредителей (участников) соискателя лицензии или лицензиата требованиям, установленным Законом о рынке ценных бумаг и ЦБ РФ
4. Аренда офиса:

4. 1.Обеспечение получения почтовых отправлений по юридическому адресу (месту нахождения) – обязательно заключение договора со ФГУП «Почта России»

4.2.Обеспечение нахождения единоличного исполнительного органа и контролера по юридическому адресу (месту нахождения),  с  даты представления документов для получения лицензии в Банк России

 

Дополнительные лицензионные требования к профессиональным участникам рынка ценных бумаг, осуществляющих брокерскую деятельность и (или) дилерскую деятельность, и (или) деятельность по управлению ценными бумагами

1. Наличие как минимум одного работника (специалиста) по ведению внутреннего учета, отвечающего квалификационным требованиям, установленным Законом о рынке ценных бумаг.
2. Наличие как минимум одного работника (специалиста) по каждому из указанных видов профессиональной деятельности на рынке ценных бумаг, отвечающего квалификационным требованиям, установленным Законом о рынке ценных бумаг.

 

Дополнительные лицензионные требования к профессиональным участникам рынка ценных бумаг, осуществляющих депозитарную деятельность

1. Наличие как минимум двух работников (руководящего работника и специалиста) по указанному виду профессиональной деятельности на рынке ценных бумаг, отвечающих квалификационным требованиям, установленным Законом о рынке ценных бумаг, не занимающие аналогичные должности в других организациях.
2. При совмещении депозитарной деятельности с другим (и) видом (ами) профессиональной деятельности на рынке ценных бумаг  обязательным также является наличие структурного подразделения по осуществлению исключительно депозитарной деятельности
3. Обмен депозитарием документами в электронной форме с электронной подписью, в том числе с усиленной электронной подписью.

 

Квалификационные требования к работникам соискателя лицензии или лицензиата:

Для получения лицензий на брокерскую, дилерскую деятельность необходимы руководитель организации, контролер и 3 специалиста с аттестатами 1–го типа Итого – 5 аттестатов 1-го типа.

Для получения лицензий на брокерскую, дилерскую деятельность и ДУ необходимы руководитель организации, контролер и 4 специалиста с аттестатами 1–го типа. Итого – 6 аттестатов 1-го типа.

Контролер обязан иметь аттестаты, покрывающие все виды деятельности.

 

Дополнительные требования к сотрудникам:

1. Руководитель организации  – аттестат 1-го типа, высшее образование любое, стаж в должности не ниже начальника отдела в организации, имевшей в тот момент лицензию ФСФР (ФКЦБ) — 2 года (при этом его деятельность должна быть связана с принятием решений по ценным бумагам), отсутствие факта работы в организации в момент совершения нарушений, за которые была аннулирована лицензия на должности руководителя или контролера в течение 3-х лет, справка об отсутствии судимости и дисквалификации, основное место работы.
2. Контролер – аттестат 1-го типа, высшее образование юридическое или экономическое, отсутствие факта работы в организации в момент совершения нарушений, за которые была аннулирована лицензия на должности руководителя или контролера в течение 3-х лет, справка об отсутствии судимости, основное место работы, обязательное прохождение целевого инструктажа по ПОД/ФТ до назначения на должность.

При рассмотрении заявления о выдачи лицензии ЦБ РФ проверяет сведения, указанные в документах, в том числе, его сотрудники выезжают по адресу государственной регистрации соискателя лицензии для осуществления выездной проверки.

Учитывая объем предоставляемых соискателем лицензии документов, повышенные требования к их оформлению для получения лицензии профессионального участника рынка ценных бумаг рекомендуется обращаться к профессиональным юристам, которые уже на начальном этапе помогут определить, отвечает ли компания, желающая получить лицензию, всем требованиям, предъявляемым к соискателю лицензии, имеет ли она все необходимые документы и инфраструктуру, необходимую для получения лицензии, а также помогут подготовить и подать комплект документов в ЦБ РФ, а в дальнейшем — проконтролировать процесс получения лицензии.

 

Наша правовая поддержка в процессе лицензирования профессионального участника рынка ценных бумаг включает в себя следующий комплекс услуг:

1. Подготовка комплекта необходимых документов, в том числе внутренних  документов, необходимых для получения лицензии, оценка офиса, оценка персонала, оценка собственных средств на предмет соответствия требованиям лицензирующего органа.
2. Правовое сопровождение рассмотрения документов в лицензирующем органе (Банке России), в том числе редактирование документов с учетом изменений в законодательстве в период  их нахождения в Банке России, ответы на возможные запросы лицензирующего органа, оказание клиенту содействия в процессе выездной проверки Банка России.
3. Проверка соответствия компании и ее документов требованиям Банка России в течение всего срока рассмотрения документов.

Стоимость наших услуг и порядок оплаты определяется индивидуально по письменному запросу клиента.

 

Срок исполнения

На подготовку документов для подачи в Банк России уходит около 1-2 месяца (при наличии офиса, аттестованных сотрудников). ЦБ РФ рассматривает и принимает решение о выдаче либо об отказе в выдаче лицензии в течение 60 рабочих дней с даты получения комплекта документов (то есть около 3 месяцев). Всего на получение лицензии уходит как минимум 4-5 месяцев.

Дополнительные услуги, предоставляемые нашей компанией: создание юридического лица – соискателя лицензии, подбор аттестованного персонала, ведение бухгалтерского учета, получение справок об отсутствии судимости и прочее.

 

Дополнительные разделы:

 

Лицензии — Банк Санкт-Петербург

• Генеральная лицензия Банка России № 436 от 31.12.2014 на осуществление банковских операций.
• Лицензия Профессионального участника рынка ценных бумаг на осуществление депозитарной деятельности №178-03967-000100 от 15.12.2000 г., выдана ФКЦБ России, без ограничения срока действия.
• Лицензия Профессионального участника рынка ценных бумаг на осуществление брокерской деятельности №178-03506-100000 от 07.12.2000 г. , выдана ФКЦБ России, без ограничения срока действия.
• Лицензия Профессионального участника рынка ценных бумаг на осуществление дилерской деятельности №178-03608-010000 от 07.12.2000 г., выдана ФКЦБ России, без ограничения срока действия.
• Лицензия на осуществление операций с драгоценными металлами № 436 от 31.12.2014 г., выдана ЦБ Российской Федерации.
• Лицензия ЛСЗ № 0000934 Рег. № 1086Н от 21.06.2017 на осуществление разработки, производства, распространения шифровальных (криптографических) средств, информационных систем и телекоммуникационных систем, защищенных с использованием шифровальных (криптографических) средств, выполнение работ, оказание услуг в области шифрования информации, технического обслуживания шифровальных (криптографических) средств, информационных систем и телекоммуникационных систем, защищенных с использованием шифровальных (криптографических) средств.
• Свидетельство о включении банка в реестр банков-участников системы обязательного страхования вкладов
• Лицензия ГТ № 0096793 рег. № 10003 от 31 января 2018 г. на осуществление работ, составляющих государственную тайну, выдана Управлением ФСБ РФ по г. Санкт-Петербургу и Ленинградской обл.
• Лицензия КИ 0101 рег. № 1205 от 30 июля 2010 г. на деятельность по технической защите конфиденциальной информации, выдана ФС по техническому и экспортному контролю.

---

Контакты органа, выдавшего лицензии профессионального участника рынка ценных бумаг

107016, Россия, г. Москва, ул. Неглинная, 12
Контактные телефоны: 8 /800/ 300 3000, 8 /499/ 300 3000

Банковский надзор за деятельностью кредитной организации осуществляет Служба текущего банковского надзора Банка России. Телефоны Контактного центра Центрального банка Российской Федерации: 8 /800/ 250 4072, 8 /495/ 771 9100.

Надзор за соблюдением требований законодательства Российской Федерации в сфере защиты

прав потребителей финансовых услуг осуществляет Служба по защите прав потребителей и обеспечению доступности финансовых услуг Банка России. Обращение о нарушении действиями (бездействием) кредитной организации законодательства Российской Федерации, а также охраняемых законом прав и интересов физических и юридических лиц, может быть направлено для рассмотрения в Банк России через интернет-приемную (www.cbr.ru/Интернет-приемная).

Надзор за деятельностью Банка выступающего в качестве профессионального участника рынка ценных бумаг осуществляет Банк России. Сайт: www.cbr.ru

Раскрытие информации профессиональным участником рынка ценных бумаг

1	Полное и сокращенное фирменное наименование профессионального участника рынка ценных бумаг, в том числе на иностранном языке (при наличии двух последних)	Полное наименование банка — Акционерное общество «ОТП Банк». Сокращенное наименование банка — АО «ОТП Банк» Полное наименование банка на английском языке — Joint Stock Company «OTP Bank». Сокращенное наименование банка на английском языке — JSC «OTP Bank».		23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
2	Идентификационный номер налогоплательщика	7708001614		23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
3	Адрес профессионального участника рынка ценных бумаг, указанный в ЕГРЮЛ	125171, г.Москва, Ленинградское шоссе, д.16А, стр.2.		23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
4	Номер телефона, факса (при наличии последнего) профессионального участника рынка ценных бумаг	Телефон: +7 (495) 775-4-775 Факс:+7 (495) 792-32-21		23. 05.2016		Информация актуальна по настоящее время
5	Адрес электронной почты профессионального участника рынка ценных бумаг	[email protected]		23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
6	Электронные копии всех лицензий на осуществление профессиональной деятельности на рынке ценных бумаг, созданные посредством сканирования	— Лицензия профессионального участника рынка ценных бумаг на осуществление брокерской деятельности, № 177-03494-100000, выдана ФКЦБ России 07.12.2000г., без ограничения срока действия; — Лицензия профессионального участника рынка ценных бумаг на осуществление дилерской деятельности, № 177-03597-010000, выдана ФКЦБ России 07. 12.2000г., без ограничения срока действия; — Лицензия профессионального участника рынка ценных бумаг на осуществление депозитарной деятельности, № 177-04136-000100, выдана ФКЦБ России 20.12.2000г., без ограничения срока действия;		30.06.2017		Информация актуальна по настоящее время
7	Информация о приостановлении действия лицензий, которыми обладает профессиональный участник рынка ценных бумаг, с указанием даты и причины приостановления	Факты приостановления действия лицензий отсутствуют		23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
8	Информация о возобновлении действия лицензий, которыми обладает профессиональный участник рынка ценных бумаг, с указанием даты возобновления действия лицензий	Факты возобновления действия лицензий отсутствуют		23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
9	Информация о принятии профессиональным участником рынка ценных бумаг решения о направлении в Банк России заявления об аннулировании лицензии на осуществление профессиональной деятельности на рынке ценных бумаг	Факты принятия решений об аннулировании лицензий отсутствуют		23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
10	Информация об аннулировании лицензии в связи с нарушением профессиональным участником рынка ценных бумаг законодательства Российской Федерации или в связи с принятием Банком России решения об аннулировании лицензии на основании заявления профессионального участника рынка ценных бумаг. Информация раскрывается, в случае если у профессионального участника рынка ценных бумаг имеются иные действующие лицензии на осуществление профессиональной деятельности на рынке ценных бумаг	Банк России 29.06.2017 года принял решение об аннулировании лицензии профессионального участника рынка ценных бумаг на осуществление деятельности по управлению ценными бумагами от 07.12.2000 № 177-03688-001000 без ограничения срока действия, выданной Акционерному обществу «ОТП Банк» (ИНН 7708001614) (далее – Общество). Основанием для принятия решения послужил факт неосуществления Обществом профессиональной деятельности на рынке ценных бумаг в течение более 18 месяцев.		30.06.2017		Информация актуальна по настоящее время
11	Информация о членстве в саморегулируемых организациях профессиональных участников рынка ценных бумаг (далее — СРО), в случае исключения из СРО профессиональный участник рынка ценных бумаг раскрывает информацию об этом с указанием даты и причины исключения	Саморегулируемая организация «Национальная финансовая ассоциация» (СРО НФА) Членство в Национальной ассоциации участников фондового рынка (НАУФОР) добровольно прекращено 10 мая 2017 года.		10.05.2017		Информация актуальна по настоящее время
12	Информация о стандартах СРО, которыми руководствуется профессиональный участник рынка ценных бумаг при осуществлении своей деятельности	Базовые стандарты Внутренние стандарты		23.12.2019		Информация актуальна по настоящее время
13	Перечень филиалов, представительств и иных обособленных подразделений, осуществляющих профессиональную деятельность на рынке ценных бумаг (при наличии), с указанием полного (при наличии — сокращенного) наименования, адреса, номера телефона, факса (при наличии последнего)	Филиалы, осуществляющие профессиональную деятельность на рынке ценных бумаг отсутствуют.		23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
14	Образец договора (образцы договоров), предлагаемый (предлагаемые) профессиональным участником рынка ценных бумаг своим клиентам при предоставлении им услуг (при наличии) (далее — образец договора)	Депозитарный договор заключается путём присоединения заинтересованного лица к «Условиям осуществления депозитарной деятельности АО «ОТП Банк»» в соответствии со ст. 428 ГК РФ.		05.06.2020		Информация актуальна по настоящее время
	Документ утвержден Приказом по Банку №173 от 26.03.2021	Регламент оказания брокерских услуг		30.03.2021		Информация актуальна по настоящее время
	Документ утвержден Приказом по Банку №220 от 08.05.2020	Регламент оказания брокерских услуг		08.05.2020		30.03.2021
	Документ утвержден Приказом по Банку №708 от 30.10.2019	Регламент оказания брокерских услуг		30.10.2019		08.05.2020
	Документ утвержден Приказом по Банку №176 от 23.04.2018	Регламент оказания брокерских услуг		23.04.2018		30.10.2019
	Документ утвержден Приказом по Банку №643 от 15.11.2017	Регламент оказания брокерских услуг		15.11.2017		23.04.2018
	Документ утвержден Приказом по Банку №345 от 29.06.2011	Регламент оказания брокерских услуг		29.06.2011		15.11.2017
	Документ утвержден Приказом по Банку №350 от 01.06.2010	Регламент оказания брокерских услуг		01.06.2010		29.06.2011
15	Порядок признания лиц квалифицированными инвесторами АО ОТП Банк Документ утвержден Приказом по Банку №933 от 19.12.2019	Порядок признания лиц квалифицированными инвесторами АО ОТП Банк		23.12.2019		Информация актуальна по настоящее время
16	Информация о технических сбоях в автоматизированных системах профессионального участника рынка ценных бумаг, которые повлекли прекращение (ограничение) работоспособности таких систем, что привело к отсутствию возможности осуществления деятельности профессионального участника рынка ценных бумаг в отношении всех клиентов профессионального участника рынка ценных бумаг на протяжении одного часа подряд, с указанием даты, времени и причин прекращения, а для профессиональных участников рынка ценных бумаг, оказывающих услуги по хранению сертификатов ценных бумаг и (или) учету и переходу прав на ценные бумаги или осуществляющих профессиональную деятельность по ведению реестра владельцев ценных бумаг, — одного календарного дня с указанием даты, времени и причин прекращения осуществления деятельности профессионального участника рынка ценных бумаг	Факты технических сбоев не зафиксированы		23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
17	Информация о возобновлении работоспособности автоматизированных систем профессионального участника рынка ценных бумаг после сбоев, которые повлекли прекращение (ограничение) работоспособности таких систем, что привело к отсутствию возможности осуществления деятельности профессионального участника рынка ценных бумаг в отношении всех клиентов профессионального участника рынка ценных бумаг на протяжении одного часа подряд, с указанием даты, времени и причин прекращения, а для профессиональных участников рынка ценных бумаг, оказывающих услуги по хранению сертификатов ценных бумаг и (или) учету и переходу прав на ценные бумаги или осуществляющих профессиональную деятельность по ведению реестра владельцев ценных бумаг, — одного календарного дня с указанием даты, времени и причин прекращения осуществления деятельности профессионального участника рынка ценных бумаг	Факты технических сбоев не зафиксированы		23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
18	Информация о существенных судебных спорах профессионального участника рынка ценных бумаг, а также его дочерних и зависимых обществ, решения по которым могут существенным образом повлиять на финансовое положение или хозяйственную деятельность профессионального участника рынка ценных бумаг (в целях настоящего Указания, если исковые требования выражены в денежном эквиваленте, судебный спор является существенным, когда исковые требования превышают 10 процентов от валюты баланса профессионального участника рынка ценных бумаг)	Факты существенных судебных споров не зафиксированы		23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
19	Профессиональный участник рынка ценных бумаг, осуществляющий брокерскую деятельность (далее — брокер), дополнительно раскрывает:
19.1	Перечень клиринговых организаций, с которыми брокер заключил договоры об оказании ему клиринговых услуг (при наличии), с указанием их полного фирменного наименования	Небанковская кредитная организация-центральный контрагент «Национальный Клиринговый Центр» (Акционерное общество) Небанковская кредитная организация акционерное общество «Национальный расчетный депозитарий»	23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
19.2	Перечень организаторов торговли, в том числе иностранных, где брокер является участником торгов, с указанием полного фирменного наименования организатора торговли	Публичное акционерное общество «Московская Биржа ММВБ-РТС»	23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
19.3	Информация о приостановлении допуска брокера к организованным торгам	Факты приостановления допуска брокера к организованным торгам отсутствуют	23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
19.4	Информация о приостановлении допуска брокера к клиринговому обслуживанию	Факты приостановления допуска брокера к клиринговому обслуживанию отсутствуют	23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
20	Профессиональный участник рынка ценных бумаг, осуществляющий депозитарную деятельность (далее — депозитарий), дополнительно раскрывает:
20.1	Условия осуществления депозитарной деятельности	Условия осуществления депозитарной деятельности	05.06.2020		Информация актуальна по настоящее время
20.2	Формы документов, представляемые депонентами в депозитарий	Типовые документы	05.06.2020		Информация актуальна по настоящее время
20.3	Формы документов, представляемые депозитарием депонентам	Типовые документы	05.06.2020		Информация актуальна по настоящее время
20.4	Перечень регистраторов и депозитариев, в том числе иностранных, в которых депозитарию открыты лицевые счета (счета депо) номинального держателя, с указанием полного фирменного наименования регистратора или депозитария	1. Небанковская кредитная организация акционерное общество «Национальный расчетный депозитарий» 2. Акционерное общество «Независимая регистраторская компания Р.О.С.Т.» 3. Акционерное общество «Межрегиональный регистраторский центр» 4. Банк ВТБ (публичное акционерное общество) 5. Государственная корпорация развития «ВЭБ.РФ»	23.05.2016		Информация актуальна по настоящее время
20.5	Адрес электронной почты профессионального участника рынка ценных бумаг (по депозитарной деятельности)	[email protected]		23.06.2019		Информация актуальна по настоящее время

Информация, подлежащая раскрытию профессиональными участниками рынка ценных бумаг

Дата раскрытия информации

Информация, подлежащая раскрытию профессиональными участниками рынка ценных бумаг

Период актуальности информации

29.03.2021

Условия осуществления депозитарной деятельности являются приложением к Договору об оказании брокерских, депозитарных и иных услуг на рынке ценных бумаг, в указанном Договоре приведены так же формы документов, представляемые депонентами в депозитарий и депозитарием депонентам, действуют с 01.04.2021г. 
Договор об оказании брок. депозитарн. услуг на рынке ЦБ (01.04.2021).pdf

Актуально
Бессрочно

29.03.2021

Актуально
Бессрочно

27.11.2019

Условия осуществления депозитарной деятельности являются приложением к Договору об оказании брокерских, депозитарных и иных услуг на рынке ценных бумаг, в указанном Договоре приведены так же формы документов, представляемые депонентами в депозитарий и депозитарием депонентам, действуют с 01.12.2019г.
Договор об оказании брок. депозитарн. услуг на рынке ЦБ (01.12.2019).doc

Актуально
до 31.03.2021

27.11.2019

Актуально
до 31.03.2021

29.05.2019

Сведения о тарифах или тарифной политике на услуги депозитария, действующие с 1 июня 2019г.:

Актуально
Бессрочно

13.11.2018

Условия осуществления депозитарной деятельности являются приложением к Договору об оказании брокерских, депозитарных и иных услуг на рынке ценных бумаг, в указанном Договоре приведены так же формы документов, представляемые депонентами в депозитарий и депозитарием депонентам, действуют с 16.11.2018г. 

Договор об оказании брок. депозитарн. услуг на рынке ЦБ (2018).pdf

Актуально
до 30.11.2019

13.11.2018

Актуально
до 30.11.2019

11.07.2018

Актуально
Бессрочно

11.07.2018

Изменения, внесенные в образец договора, предлагаемый профессиональным участником рынка ценных бумаг своим клиентам при предоставлении им услуг и в Условия осуществления депозитарной деятельности
Изменение в Договор.pdf

Актуально
до 15.11.2018

11.07.2018

Адрес профессионального участника рынка ценных бумаг, указанный в ЕГРЮЛ: 654080, Россия, Кемеровская обл., г. Новокузнецк, ул. Кирова, 89б 

Актуально
Бессрочно

27.09.2017

Условия осуществления депозитарной деятельности являются приложением к Договору об оказании брокерских, депозитарных и иных услуг на рынке ценных бумаг, в указанном Договоре приведены так же формы документов, представляемые депонентами в депозитарий и депозитарием депонентам, действуют с 01.10.2017г. 
Договор об оказании брокерских депозитарных услуг на рынке ЦБ (01.10.17).pdf

Актуально
до 15.11.2018

27.09.2017

Актуально
до 15.11.2018

27.03.2017

Сведения о тарифах или тарифной политике на услуги депозитария, действующие с 1 апреля 2017г.:
Тарифы c 01.04.17.pdf

Актуально
до 31.05.2017

06.03.2017

Банк осуществляет признание квалифицированных инвесторов в соответствии с Регламентом принятия решения о признании лица квалифицированным инвестором в АО «Кузнецкбизнесбанк»
Регламент.docx

Актуально
Бессрочно

15.11.2016

Условия осуществления депозитарной деятельности являются приложением к Договору об оказании брокерских, депозитарных и иных услуг на рынке ценных бумаг, в указанном Договоре приведены так же формы документов, представляемые депонентами в депозитарий и депозитарием депонентам. Действовали с 01.12.2016г.
Договор об оказании брок. депозитарн. услуг на рынке ЦБ (01.12.16)..pdf

Актуально
до 30.09.2017

15.11.2016

Актуально
до 30.09.2017

10.11.2016

Клиринговая организация, с которой банк заключил договор об оказании ему клиринговых услуг: Небанковская кредитная организация акционерное общество «Национальный расчетный депозитарий» www.nsd.ru

Актуально
Бессрочно

28.06.2016

Сведения о тарифах или тарифной политике на услуги депозитария, действующие с 1 июля 2016г.:

тарифы до 01.04.17.pdf

Актуально
до 01.04.2017

23.05.2016

Актуально
Бессрочно

23.05.2016

Актуально
Бессрочно

23.05.2016

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Полное и сокращенное фирменное наименование профессионального участника рынка ценных бумаг, в том числе на иностранном языке: Акционерный Банк «Кузнецкбизнесбанк» (акционерное общество), Kuznetskbusinessbank (joint-stock company), АО «Кузнецкбизнесбанк», Kuznetskbusinessbank (JSC)

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Идентификационный номер налогоплательщика: 4216004076

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Адрес профессионального участника рынка ценных бумаг, указанный в ЕГРЮЛ: 654080, Россия, Кемеровская обл., г. Новокузнецк, ул. Кирова, 89 «А»

Актуально
до 10.07.2018

25.02.2016

Номер телефона, факса профессионального участника рынка ценных бумаг: тел. (3843)76-32-40, факс (3843)76-60-90

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Адрес электронной почты профессионального участника рынка ценных бумаг: [email protected]

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Актуально
до 23.05.2016

25.02.2016

Актуально
до 23.05.2016

25.02.2016

Актуально
до 23.05.2016

25.02.2016

Банк с 11.12.2015г. является членом саморегулируемой организации профессиональных участников рынка ценных бумаг (далее — СРО) — Саморегулируемая организация «Национальная финансовая ассоциация» (до 06.04.2016г. — «Национальная фондовая ассоциация (саморегулируемая некоммерческая организация)»). Со стандартами СРО, которыми руководствуется профессиональный участник рынка ценных бумаг при осуществлении своей деятельности можно ознакомиться по ссылке.

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Банк не имеет филиалов, представительств и иных обособленных подразделений, осуществляющих профессиональную деятельность на рынке ценных бумаг.

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Актуально
до 30.11.2016

25.02.2016

Банк не является клиентским брокером в соответствии с Указанием Банка России от 25 июля 2014 года № 3349-У «О единых требованиях к правилам осуществления брокерской деятельности при совершении операций с имуществом клиента брокера».

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Клиринговая организация, с которой банк заключил договор об оказании ему клиринговых услуг: Банк «Национальный Клиринговый Центр» (Акционерное общество) www.nkcbank.ru

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Организатор торговли, где банк является участником торгов: Публичное акционерное общество «Московская Биржа ММВБ-РТС» moex.com

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Банк не осуществляет признание квалифицированных инвесторов.

Актуально
до 05.03.2017

25.02.2016

Банк не открывал специальные брокерские счета в кредитных организациях.

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Банк не осуществляет деятельность по управлению ценными бумагами, деятельность по ведению реестра владельцев ценных бумаг.

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Условия осуществления депозитарной деятельности являются приложением к Договору об оказании брокерских, депозитарных и иных услуг на рынке ценных бумаг, в указанном Договоре приведены так же формы документов, представляемые депонентами в депозитарий и депозитарием депонентам
Договор об оказании брок. депозитарн. услуг на рынке ЦБ (01.06.14).pdf

Актуально
до 30.11.2016

25.02.2016

Депозитарии, в которых банку открыты лицевые счета (счета депо) номинального держателя: Небанковская кредитная организация акционерное общество «Национальный расчетный депозитарий» www.nsd.ru (до 31.05.2016г. Небанковская кредитная организация закрытое акционерное общество «Национальный расчетный депозитарий»), государственная корпорация развития «ВЭБ.РФ» (до 14.12.2018г. государственная корпорация «Банк развития и внешнеэкономической деятельности (Внешэкономбанк)») www.veb.ru.

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Банк является участником в следующих ассоциациях, объединениях, и (или) банковских группах:

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Ассоциация региональных банков России

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Кузбасская торгово-промышленная палата

Актуально
Бессрочно

25.02.2016

Сведения о тарифах или тарифной политике на услуги депозитария:
тарифы c 01.01.16.pdf

Актуально
до 30.06.2016

Лицензии — Росбанк

 

 

Генеральная лицензия на осуществление банковских операций
Номер лицензии: 2272
Дата получения 28.01.2015
Орган, выдавший лицензию: Банк России
Срок действия лицензии: Без ограничения срока действия 

Лицензия на привлечение во вклады и размещение драгоценных металлов
Номер лицензии: 2272
Дата получения: 28.01.2015
Орган, выдавший лицензию: Банк России
Срок действия лицензии: Без ограничения срока действия  

Лицензия профессионального участника рынка ценных бумаг на осуществление брокерской деятельности 
Номер лицензии: 177-05721-100000
Дата получения: 06.11.2001
Орган, выдавший лицензию: ФКЦБ России
Срок действия лицензии: Без ограничения срока действия  

Лицензия профессионального участника рынка ценных бумаг на осуществление дилерской деятельности 
Номер лицензии: 177-05724-010000
Дата получения: 06.11.2001
Орган, выдавший лицензию: ФКЦБ России
Срок действия лицензии: Без ограничения срока действия 

Лицензия профессионального участника рынка ценных бумаг на осуществление депозитарной деятельности 
Номер лицензии: 177-05729-000100
Дата получения: 13.11.2001
Орган, выдавший лицензию: ФКЦБ России
Срок действия лицензии: Без ограничения срока действия   

Лицензия на осуществление деятельности специализированного депозитария инвестиционных фондов, паевых инвестиционных фондов и негосударственных пенсионных фондов 
Номер лицензии: 22-000-0-00029
Дата получения: 17.01.2001
Орган, выдавший лицензию: ФКЦБ России
Срок действия лицензии: Без ограничения срока действия

Лицензия на осуществление разработки, производства, распространения шифровальных (криптографических) средств, информационных систем и телекоммуникационных систем, защищенных с использованием шифровальных (криптографических) средств, выполнения работ, оказания услуг в области шифрования информации, технического обслуживания шифровальных (криптографических) средств, информационных систем и телекоммуникационных систем, защищенных с использованием шифровальных (криптографических) средств (за исключением случая, если техническое обслуживание шифровальных (криптографических) средств, информационных систем и телекоммуникационных систем, защищенных с использованием шифровальных (криптографических) средств, осуществляется для обеспечения собственных нужд юридического лица или индивидуального предпринимателя).
Номер лицензии: ЛСЗ  0016476
Регистрационный номер: 17309Н
Дата получения: 28.06.2019
Орган, выдавший лицензию: Центр по лицензированию, сертификации и защите государственной тайны ФСБ России
Срок действия лицензии: бессрочно

Лицензия на деятельность по технической защите конфиденциальной информации
Номер лицензии: Бланк КИ 0302 № 015178
Регистрационный номер: 3547
Дата получения : 06.12.2018
Орган, выдавший лицензию: Федеральная служба по техническому и экспортному контролю
Срок действия лицензии: бессрочно

Лицензия на оказание телематических услуг связи 
Номер лицензии: № 179990
Дата получения: 10.01.2020
Орган, выдавший лицензию: Федеральная служба по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций
Срок действия лицензии: 10.01.2025

Профилирование лиганда каннабиноидного рецептора CB2 выявляет смещенную передачу сигналов и нецелевую активность

Общие материалы

[ ³ H] CP55940 (удельная активность 141,2 Ки, ммоль, ^-1 ) и фильтры GF-B / GF-C были приобретены у Перкин Элмер (Уолтем, Массачусетс, США). Анандамид [арахидонил-5,6,8,9,11,12,14,15- ³ H; AEA] (удельная активность 200 Ки, ммоль ^-1 ) был приобретен у ARC (Сент-Луис, Миссури, США). Бицинхониновая кислота (BCA) и реагент для анализа белка BCA были получены от Pierce Chemical Company (Рочфорд, Иллинойс, США).Клеточные линии β-аррестина PathHunter CHO-K1 CNR1, CNR2 и mCNR2 (каталожные номера 93-0959C2, 93-0706C2 и 93-0472C2 соответственно) и набор для обнаружения PathHunter (каталожный номер 93-0001) были получены от DiscoveRx. Планшеты для клеточных культур были приобретены у Sarstedt (каталожный номер 83.3902) и 384-луночные аналитические планшеты с белыми стенками у Perkin Elmer (каталожный номер 6007680). Каннабиноидный эталонный лиганд CP55940, (Rac) -AM1241, AEA и 2-арахидоноилглицерин (2-AG) были получены от Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США), JWh233 и Gp-1a от Tocris Bioscience (Бристоль, Великобритания), SR144528 , (S) -AM1241 и ( R ) -AM1241 от Cayman Chemical Company (Анн-Арбор, Мичиган, США) и HU308, HU910, HU210, SR141716A, AM630, мезилат WIN55212-2 и AM251 были получены от Hoffman-La. Рош (Базель, Швейцария).Δ ⁹ -THC и JWH015 были синтезированы в соответствии с опубликованными процедурами (см. Ниже) ^40,41,42 . Не все соединения были протестированы во всех лабораториях из-за юридических ограничений. URB597 и JZL184 были от Cayman Chemicals (Анн-Арбор, Мичиган, США). Зонды на основе активности для сериновых гидролаз MB064 и TAMRA-FP были синтезированы согласно литературным данным ⁴³ или были приобретены у Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA), соответственно. Все буферы и растворы были приготовлены с использованием воды Millipore (деионизированной с использованием MilliQ A10 Biocel, с 0.Фильтр 22 мкм) и реагенты и растворители аналитической чистоты. Буферы готовят при комнатной температуре (RT) и хранят при 4 ° C, если не указано иное.

Синтетические процедуры Общие замечания

Все реакции проводились с использованием печи или высушенной пламенем стеклянной посуды и сухих растворителей. Реагенты были приобретены у Sigma Aldrich, Acros и Merck и использовались без дополнительной очистки, если не указано иное. Все чувствительные к влаге реакции проводили в атмосфере аргона. Следы воды были удалены из исходных соединений путем совместного выпаривания с толуолом.Спектры ¹ H и ¹³ C-ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker AV 400 МГц при 400,2 ( ¹ H) и 100,6 ( ¹³ C) МГц. Значения химического сдвига указаны в ppm с тетраметилсиланом или резонансом растворителя в качестве внутреннего стандарта (CDCl ₃ δ 7,26 для ¹ H, δ 77,0 для ¹³ C, CD ₃ OD: δ 3,31 для ¹ H ). Данные представлены следующим образом: химические сдвиги (δ), множественность (s = синглет, d = дублет, dd = двойной дублет, td = тройной дублет, t = триплет, q = квартет, квинт = квинт, br = широкий, m = мультиплет), константы связи J (Гц) и интегрирование.Очистку ВЭЖХ проводили в системе препаративной ЖХ-МС (Agilent 1200serie) с четырехъядерным детектором Agilent 6130 MS. Масс-спектры высокого разрешения записывали на Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL. Флэш-хроматографию проводили на силикагеле SiliCycle типа SiliaFlash P60 (230–400 меш). ТСХ-анализ выполнен на силикагеле Merck 60 / Kieselguhr F254, 0,25 мм.

Химический синтез подробно описан в дополнительных методах.

Клеточная культура и подготовка мембран

CHOK1hCB ₁ _bgal, CHOK1hCB ₂ _bgal и CHOK1mCB ₂ _bgal Клетки (источник: DiscoveRx, Фремонт, Калифорния, США) культивировали в смеси Ham’s F12 Nutrient Mixal 10% сыворотка теленка, 1 мМ глутамин, 50 мкг мл ^-1 пенициллин, 50 мкг мл ^-1 стрептомицин, 300 мг мл ^-1 гигромицин и 800 мкг мл ^-1 генетицин во влажной атмосфере при 37 ° C и 5% CO ₂ .Клетки пересевали дважды в неделю в соотношении 1:20 на чашки диаметром 10 см путем трипсинизации. Для приготовления мембран клетки пересевали 1:10 и переносили на большие чашки диаметром 15 см. Для приготовления мембран клетки отделяли соскабливанием в 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), собирали и центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин. Гранулы, полученные из 30 чашек, добавляли вместе и ресуспендировали в 20 мл ледяного буфера (50 мМ Трис-HCl, 5 мМ MgCl ₂ , pH 7.4). Гомогенизатор UltraThurrax использовали для гомогенизации клеточной суспензии. Мембраны и цитозольную фракцию разделяли ультрацентрифугированием (31000 об / мин, с ротором Ti-70 в ультрацентрифуге Beckham Coulter) при 4 ° C в течение 20 минут. Супернатант отбрасывали, осадок ресуспендировали в 10 мл того же буфера и повторяли этапы гомогенизации и центрифугирования. Супернатант удаляли и осадок ресуспендировали в 5 мл буфера. Аликвоты по 200 мкл замораживали при -80 ° C до дальнейшего использования.Концентрацию белка определяли с использованием метода BCA ⁴⁴ .

[

³ H] Анализ замещения CP55940

[ ³ H] Анализ замещения CP55940 использовался для определения значений сродства (K _i ) лигандов для каннабиноидов CB ₁ и CB ₂ рецепторы. Мембранные аликвоты, содержащие 5 мкг (CHOK1hCB ₁ _bgal) или 1 мкг (CHOK1hCB ₂ _bgal) мембранного белка в 100 мкл буфера для анализа (50 мМ Tris-HCl, 5 мМ MgCl ₂ , 0.1% бычий сывороточный альбумин (BSA), pH 7,4) инкубировали при 30 ° C в течение 1 ч в присутствии 3,5 нМ [ ³ H] CP55940 (CHOK1hCB ₁ _bgal) или 1,5 нМ [ ³ H] CP55940 (CHOK1hCB ₂ _bgal). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 10 мкМ AM630 (CHOK1hCB ₂ _bgal) или 10 мкМ SR141716A (CHOK1hCB ₁ _bgal). Когда в качестве лигандов использовали AEA или 2-AG, в качестве ингибитора сериновой протеазы использовали фенилметилсульфонилфторид. Инкубацию завершали быстрой фильтрацией, выполняемой на фильтрах GF / C (Whatman International, Maidstone, UK), предварительно пропитанных в течение 30 минут 0.25% PEI, используя харвестер Brandel (Брандел, Гейтерсбург, Мэриленд, США). Связанную с фильтром радиоактивность определяли сцинтилляционной спектрометрией с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика Tri-Carb 2900 TR (Perkin Elmer, Бостон, Массачусетс, США). Для экспериментов на мышах мозг (для CB ₁ ) и селезенка (для CB ₂ ) ресуспендировали в 2 мМ Трис-ЭДТА, 320 мМ сахарозе, 5 мМ MgCl ₂ (pH 7,4), затем гомогенизировали в Potter гомогенизатор и трижды центрифугировали при 1000 g (10 мин).Супернатанты центрифугировали при 18000 g (30 мин), и осадки ресуспендировали в буфере для анализа (50 мМ Трис-HCl, 2 мМ Трис-ЭДТА, 3 мМ MgCl ₂ , pH 7,4). Эти мембранные фракции использовали в анализах быстрой фильтрации с 400 пМ [ ³ H] CP55,940. Во всех экспериментах по связыванию неспецифическое связывание определяли в присутствии 1 мкМ «холодного» агониста. Когда AEA или 2-AG использовали в качестве лигандов, ингибитор FAAH URB597 или ингибитор MAGL JZL184, соответственно, были включены в буфер для анализа ⁴⁵ .Ткань головного мозга и селезенки собирали у самцов мышей C57BL / 6J в возрасте 8 месяцев (поставщик: Charles River Via Indipendenza 11 Calco (Lecco) 23885 Италия) в Фонде Санта-Лючия в рамках проекта «Ruolo del Sistema Endocannabinoide nei Processi Neurodegenerativi in Анималистические модели болезни Альцгеймера Мауро Маккарроне. Этическое одобрение было дано Министерством здравоохранения, n. 47/2014 / PR (срок до 17 ноября 2019 г.).

[

³⁵ S] GTPγS анализ

Активация G-белка рецептором измеряется по связыванию радиоактивно меченного GTP, [ ³⁵ ] GTPγS, с рецептором ⁴⁶ .Пять микрограммов гомогенизированных мембран CHOK1CB_bgal в 20 мкл буфера для анализа (50 мМ трис-HCl буфер (pH 7,4), 5 мМ MgCl ₂ , 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0,05% BSA и 1 мМ DTT, свежеприготовленные каждый день ) были предварительно обработаны 5 мкг сапонина и 1 мкМ GDP. Для определения значений pEC ₅₀ и Emax каннабиноидных эталонных лигандов мембраны инкубировали с различными концентрациями представляющих интерес лигандов. Базальный уровень связывания GTP измеряли в необработанных образцах мембран, а максимальный уровень связывания GTP измеряли путем обработки мембран 10 мкМ CP55940.Все образцы предварительно инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с последующим добавлением [ ³⁵ S] GTPγS (0,3 нМ). Общий объем каждого образца составлял 100 мкл. Образцы инкубировали в течение 90 мин при 25 ° C на платформе для встряхивания. Инкубации заканчивали быстрой вакуумной фильтрацией для разделения связанного и свободного радиолиганда через фильтры Whatman GF / B (Perkin Elmer, Гронинген, Нидерланды) с использованием 96-луночного харвестера Filtermate (Perkin Elmer, Гронинген, Нидерланды). Затем фильтры промывали десять раз ледяным промывочным буфером, содержащим 50 мМ Tris HCl, pH 7.4 и 5 мМ MgCl ₂ . К каждому фильтру добавляли сцинтилляционную жидкость Microscint (25 мкл, Perkin Elmer, Groningen, Нидерланды). Через 3 часа радиоактивность, связанную с фильтром, определяли сцинтилляционной спектрометрией с использованием сцинтилляционного счетчика 1450 Microbeta Wallac Trilux (Perkin Elmer).

Анализ набора β-аррестина PathHunter

Анализ выполняли с использованием PathHunter hCB ₁ _bgal, hCB ₂ _bgal, hGPR55_bgal или mCB ₂ _bgal CHOK1 β-аррестин набор для анализа набора Rx (источник: Discove Калифорния, США), согласно протоколу производителя ⁴⁷ .Вкратце, клетки высевали при плотности 5000 клеток на лунку твердых 384-луночных планшетов с белыми стенками (Perkin Elmer, Массачусетс, США) в 20 мкл среды для культивирования клеток и инкубировали в течение ночи (16-18 ч) во влажной атмосфере при 37 ° C. ° C и 5% CO ₂ . В эндоканнабиноидном анализе в каждую лунку добавляли свежеприготовленный фенилметилсульфонилфторид в концентрации 50 мкМ, и клетки инкубировали в течение 30 мин в увлажненной атмосфере при 37 ° C и 5% CO ₂ . В агонистическом анализе клетки стимулировали 10 мкМ каждого агониста (одноточечный анализ) или 11 возрастающими концентрациями каждого агониста и инкубировали в течение 90 минут во влажной атмосфере при 37 ° C и 5% CO ₂ .В антагонистических анализах клетки подвергали воздействию 10 мкМ каждого антагониста (одноточечный анализ) или 11 возрастающих концентраций каждого антагониста и инкубировали в течение 30 минут во влажной атмосфере при 37 ° C и 5% CO ₂ с последующим добавление концентрации CP55940 в EC80 (25 нМ для CHOK1hCB1_bgal и 46 нМ для CHOK1hCB2_bgal). Клетки инкубировали 90 мин во влажной атмосфере при 37 ° C и 5% CO ₂ . Соединения в исходных растворах ДМСО добавляли с использованием цифрового дозатора HP D300 (Tecan, Männedorf, Швейцария).Эндоканнабиноиды 2-AG и анандамид (исходные растворы в ацетонитриле) добавляли вручную. Конечная концентрация органического растворителя на точку анализа была ≤0,1%. Активность фермента β-галактозидазы определяли с использованием смеси для обнаружения PathHunter в соответствии с протоколом набора ⁴⁷ . Добавляли смесь для детектирования, 12 мкл на лунку, и планшет инкубировали в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре. Хемилюминесценцию, обозначенную как относительная световая единица, измеряли на многопозиционном планшет-ридере EnVision (Perkin Elmer, MA, США).

Анализ pERK

Анализы для определения стимуляции pERK были выполнены в клетках HEK, стабильно экспрессирующих 3HA-меченные человеческие рецепторы CB ₁ и Flp-in HEK-клетки, стабильно экспрессирующие 1HA-3TCS-меченные hCB ₂ рецепторов (3TCS относится к трем рецепторам). «сайты расщепления тромбином», которые не имеют отношения к этим экспериментам). Клетки HEK-hCB ₁ были созданы путем трансфекции клеток эмбриональной почки человека 293 (HEK) (ATCC # CRL-1573) CB ₁ (hCB ₁ ) человека, химеризованных тремя метками гемеагглютинина (HA) на аминоконце. .Одна метка HA, три сайта расщепления тромбином и один остаток L (для целей клонирования) были химеризованы на N-конце hCB ₂ (Центр ресурсов кДНК S&T штата Миссури, www.cdna.org, CNR0200000) путем перекрывания- Удлиненная ПЦР и рестрикционный гидролиз / лигирование олигонуклеотидов ДНК. Последующая конструкция hCB2 была клонирована в pcDNA5 / FRT (Life Technologies # V601020) через сайты NheI и XhoI с использованием стандартных методов молекулярной биологии и проверки последовательности. Клеточную линию человека Flp-In-293 (Invitrogen # R750-07) стабильно трансфицировали конструкцией hCB2 человека для направленной интеграции в сайт FRT и поддерживали в 50 мкг гигромицина B мл ^-1 (см.48). Клетки выращивали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и культивировали в стандартных условиях. Вкратце, клетки из полуконфлюэнтных колб Т75 высевали в 100 мкл полной среды на лунку в 96-луночные планшеты, предварительно обработанные поли-D-лизином. Приблизительно через 24 часа после посева клетки были конфлюэнтными на 60%, и всю среду удаляли и заменяли 50 мкл на лунку бессывороточной среды DMEM, содержащей 1 мг / мл ^-1 BSA, на 18 часов для уменьшения фона pERK. Лекарства готовили в DMEM + 1 мг / мл ^-1 BSA при 2-кратных концентрациях, и клетки стимулировали распределением 50 мкл на лунку на водяной бане при 37 ° C в течение точно 5 минут.По завершении стимуляции планшеты перемещали на ледяную подушку и быстро аспирировали содержимое лунки. Немедленно распределяли по 30 микролитров буфера для лизиса на лунку, и планшеты помещали на шейкеры на 10 мин перед тем, как приступить к обнаружению. Буфер для лизиса и реагенты для обнаружения были из набора для анализа PerkinElmer AlphaScreen SureFire pERK (Thr202 / Tyr204) и использовались в соответствии с инструкциями производителя. Чтобы сократить использование реагентов для обнаружения, лизаты сначала переносили на 1/2 площади белых 96-луночных планшетов (PerkinElmer).Обнаружение опосредованных hCB ₁ ответов pERK выполняли с использованием стандартного протокола обнаружения производителя, тогда как ответы hCB ₂ pERK были обнаружены только с использованием протокола обнаружения высокой чувствительности. Планшеты считывали на планшет-ридере EnSpire (PerkinElmer).

GIRK assay

Активация нативных каналов GIRK в клетках нейробластомы мыши AtT20, стабильно трансфицированных HA-меченными hCB ₁ или hCB ₂ рецепторами (источник: клетки были получены путем трансфекции WT AtT20 с HA-меченным hCB ₁ или рецептор hCB ₂ .Клоны кДНК человеческого рецептора CB ₁ и CB ₂ с 3 × N-концевыми метками НА были получены из Центра ресурсов кДНК S&T штата Миссури (www.cdna.org)). Измеряли как изменение мембранного потенциала с использованием мембранный потенциал-чувствительный краситель (синий, Molecular Devices) в трехпланшетном ридере FlexStation ^49,50 . Вкратце, клетки AtT20 из 80-90% конфлюэнтной 75-миллиметровой колбы ² ресуспендировали в среде L-15 с добавлением 1% FBS, 100 Ед пенициллина и 100 мкг стрептомицина ^-1 мл и высевали в 96-луночный черный цвет. стенки планшетов (90 мкл на лунку).Клетки инкубировали в течение ночи во влажном комнатном воздухе при 37 ° C. Краситель с мембранным потенциалом растворяли в физиологическом растворе с низким содержанием K HEPES (90 мкл) и добавляли в планшет за час до анализа. Флуоресценцию измеряли каждые 2 с ( λ, возбуждения = 530 нм, λ эмиссии = 565 нм). Анализы проводили при 37 ° C, препараты добавляли в объемах 20 мкл после минимум 2 мин регистрации исходного уровня. Изменения флуоресценции выражали в процентах от значений перед лекарством после вычитания небольших изменений, произведенных растворителем (0.1% ДМСО, 0,1% БСА) отдельно. Для экспериментов с антагонистами препараты предварительно инкубировали в течение не менее 5 минут перед добавлением CP55940 (30 нМ). Для каждой концентрации лекарственного средства изменение пика флуоресценции было нормализовано к изменению, обеспечивающему максимально эффективную концентрацию CP55–940 (1 мкМ). Данные выражены в виде среднего значения ± s.e.m. из N независимых экспериментов, каждый из которых выполнен в двух экземплярах.

Анализ цАМФ на мышах

Влияние лигандов на накопление цАМФ, стимулированное форсколином, определяли с помощью набора LANCE ULTRA cAMP (Perkin-Elmer Life Sciences, Бостон, Массачусетс, США) (см.51). Мозг (для CB ₁ ) и селезенку (для CB ₂ ) ресуспендировали в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), затем гомогенизировали в гомогенизаторе Potter и центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Супернатанты инкубировали в течение 30 мин с 1-метил-3-изобутилксантином (IBMX), затем добавляли форсколин в присутствии или в отсутствие лигандов. Супернатанты инкубировали в течение 30 мин в буфере для регенерации АТФ (50 мМ HEPES, pH 7,4, 10 мМ фосфокреатин, 10 ед. Мл ^-1 креатинфосфокиназы, 10 мкМ GTP, 200 мкМ АТФ, 10 мМ MgCl ₂ , 250 мкМ IBMX), и реакцию останавливали добавлением буфера для лизиса.Флуоресценцию с временным разрешением измеряли с помощью счетчика Victor V Multilabel (Perkin-Elmer Life Sciences, Бостон, Массачусетс, США). Ткань головного мозга и селезенки собирали у самцов мышей C57BL / 6J в возрасте 8 месяцев (поставщик: Charles River Via Indipendenza 11 Calco (Lecco) 23885 Италия) в Фонде Санта-Лючия в рамках проекта «Ruolo del Sistema Endocannabinoide nei Processi Neurodegenerativi in Анималистические модели болезни Альцгеймера Мауро Маккарроне. Этическое одобрение было дано Министерством здравоохранения, n. 47/2014 / PR (срок до 17 ноября 2019 г.).

Анализ цАМФ человека

Анализ цАМФ

проводили с клетками СНО, стабильно экспрессирующими CB ₁ человека или CB ₂ рецепторов ⁵² (источник: DiscoveRx, Фремонт, Калифорния, США) с использованием обнаружения цАМФ-Nano-TRF комплект (Roche Diagnostics, Пенцберг, Германия). Клетки высевали за 17–24 ч до эксперимента при плотности 3 × 10 ⁴ клеток на лунку в черный 96-луночный планшет с плоским прозрачным дном (Corning, Висбаден, Германия) и инкубировали в 5% CO ₂ при 37 ° C в увлажненном инкубаторе.Среду роста заменяли бикарбонатным буфером Кребса-Рингера с 1 ммоль 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX), 0,1% БСА, не содержащим жирных кислот, и инкубировали при 30 ° C в течение 60 минут. Агонист добавляли до конечного объема анализа 100 мкл и смесь инкубировали в течение 30 мин при 30 ° C. Анализ останавливали добавлением 50 мкл 3 × реагента для лизиса и встряхивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Передача энергии с временным разрешением измерялась с помощью LF502 Nanoscan FLT (IOM, Берлин, Германия), оснащенного лазером в качестве источника возбуждения.Содержание цАМФ определяли по функции стандартной кривой от 10 до 0,13 нмоль / ^-1 цАМФ.

Анализ данных функциональных анализов

Все экспериментальные данные были проанализированы с использованием программы построения кривой нелинейной регрессии GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Из анализа смещения значения pIC ₅₀ были получены с помощью нелинейного регрессионного анализа кривых смещения. Полученные значения pIC ₅₀ были преобразованы в значения pK _i с использованием уравнения Ченга Прусоффа для определения сродства лигандов (K _D : 0.33 (CB ₂ R), 0,10 (CB ₁ R)) (ссылка 53). Кривые рекрутирования β-аррестина и GTPγS анализировали с помощью варианта нелинейной регрессии «логарифм (агонист или ингибитор) в зависимости от наклона, зависящего от ответа», чтобы получить значения эффективности, ингибирующей активности или эффективности агонистов и обратных агонистов (EC ₅₀ , IC _50). или E _max соответственно). Базальная активность клеток установлена ​​на уровне 0%. Для анализа набора β-аррестина все точки данных были скорректированы для любого фона (например, фоновой люминесценции).Для анализа антагонистов, измеренных в конкуренции с CP55940, был выбран вариант нелинейной регрессии «log (ингибитор) в зависимости от ответа». Реакция агонистов на образец нормализована к эффекту 10 мкМ CP55940, а реакция антагонистов нормализована к эффекту EC ₈₀ CP55940. Для анализа GTPγS агонистический эффект нормирован на эффект 10 мкМ CP55940. Показанные данные представляют собой среднее значение ± s.e.m. по крайней мере трех независимых экспериментов, каждый из которых выполнен в двух экземплярах, если не указано иное.

Анализ данных для расчетов систематической ошибки

Данные, используемые для рабочего анализа, представляли собой данные по крайней мере трех независимых экспериментов по каждому анализу, все нормированные на эффект 10 мкМ CP55940. Используемый анализ был основан на van der Westhuizen et al . ³⁰ Для получения более подробной информации об открытии операционной модели и ее математической основе см. Black and Leff и Kenakin et al . ^31,54,55 См. Дополнительные методы для получения полной пошаговой процедуры.

Ингибирование обратного захвата AEA в клетках HaCaT

Поглощение [ ³ H] AEA измеряли в интактных клетках HaCaT (любезный подарок профессора Н.Е. Фузенига (Немецкий центр исследования рака, Гейдельберг, Германия), которые инкубировали в PBS при 37 ° C со смесью AEA [арахидонил-5,6,8,9,11,12,14,15- ³ H] (200 Ки ммоль ^-1 ) и холодного AEA (в конечной концентрации 400 нМ) в течение 15 мин (ссылка 56). Контрольные эксперименты проводили также при 4 ° C и в присутствии селективного ингибитора обратного захвата AEA OMDM-1 (10 мкМ).Эффект различных лигандов на обратный захват AEA тестировали путем добавления каждого вещества непосредственно в среду инкубации.

Ингибирование обратного захвата AEA в клетках HMC-1 и клетках U937

Скрининг соединений и определение IC50 для клеточного поглощения AEA в клетках U937 и HMC-1 (источник: клетки U937 были приобретены у ATCC, Манассас, штат Вирджиния, США, HMC- 1 клетки были подарены профессором С. Штендером из Мюнстерского университета с разрешения Фонда Майо, США). Анализировали в 96-луночном формате с использованием силанизированных стеклянных флаконов AquaSil (Chromacol 1.1-МТВ) (ссылки 32, 57). Сначала необходимое количество клеток U937 центрифугировали при 100 g в течение 5 мин и ресуспендировали в RPMI (37 ° C) до конечной концентрации 2 × 10 ⁶ клеток на мл ^-1 . Затем 250 мкл клеточной суспензии (0,5 × 10 ⁶ клеток на образец) переносили в стеклянные флаконы. После добавления 5 мкл носителя (ДМСО) или тестируемых соединений, растворенных в ДМСО при указанных конечных концентрациях, клетки инкубировали при 37 ° C в течение 15 минут. После предварительной инкубации смесь 0.Добавляли 5 нМ [этаноламин-1- ³ H] -AEA (60 Ки, ммоль ^-1 ) и 99,5 нМ холодного AEA (конечные 100 нМ), и образцы инкубировали при 37 ° C в течение еще 15 мин. . В FAAH-дефицитных клетках HMC-1 [арахидоноил-5,6,8,9,11,12,14,15- ³ H] -AEA (200 Ки ммоль ^-1 ) использовали для того, чтобы достичь лучшего отношения сигнал / фон из-за более низкой скорости поглощения AEA. Реакцию останавливали быстрой фильтрацией через фильтры UniFilter-96 GF / C (Perkin Elmer), предварительно пропитанные PBS 1% BSA.Клетки на фильтрах трижды промывали 100 мкл ледяного буфера PBS, содержащего 1% БСА без жирных кислот. После сушки в лунки добавляли 45 мкл сцинтилляционной смеси MicroScint 20 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) и планшет герметично закрывали. Радиоактивность измеряли методом жидкостной сцинтилляции на приборе Perkin Elmer Wallac Trilux MicroBeta 1450 в течение 2 мин. Образцы были измерены в трех повторностях в n = 3 независимых экспериментах, за исключением скрининга ( n = 1). Каждый запуск был подтвержден с использованием положительных контролей OMDM-2 и UCM707 в концентрации 10 мкМ, достигающей 59.7 ± 6,6% ( n = 7) и 71,5 ± 8,0% ( n = 7) соответственно.

Ингибирование NAPE-PLD

Полноразмерная кДНК человека NAPE-PLD была получена от Natsuo Ueda ⁵⁸ и клонирована в вектор экспрессии млекопитающих pcDNA3.1, содержащий C-концевую Flag-метку и гены устойчивости к ампициллину и неомицину. Все плазмиды выращивали в XL-10 Z-компетентных клетках и готовили (Maxi Prep, Qiagen). Анализ последовательностей для подтверждения последовательностей был выполнен в Лейденском технологическом центре генома.

Клетки HEK293T (источник: Голландский институт рака) культивировали при 37 ° C и 7% CO. ₂ в среде DMEM с глутамаксом, пенициллином (100 мкг мл ^-1 ), стрептомицином (100 мкг мл ^-1 ) и 10% железа в сыворотке новорожденного теленка (Hyclone Sh40072.03). Клетки пассировали дважды в неделю до подходящего слияния. За 24 часа до трансфекции 10 ⁷ клеток высевали на 15-сантиметровую чашку. За два часа до трансфекции среду обновляли. Трансфекцию проводят PEI в соотношении 3: 1 с человеческим NAPE-PLD или Mock pcDNA3.1Neo, 20 мкг на чашку. Среду обновляют через 24 часа, а клетки собирают через 72 часа. Суспензии клеток центрифугируют при 1000 g в течение 10 мин, супернатант удаляют и осадок замораживают при -80 ° C до дальнейшего использования.

Осадки клеток ресуспендировали в буфере для лизиса 1: 20 мМ Hepes, 2 мМ DTT, 0,25 М сахарозы, 1 мМ MgCl ₂ , 2,5 ед. Мл ^-1 бензоназы и инкубировали 30 мин на льду. Цитозольная фракция (супернатант) отделяется от мембран ультрацентрифугированием (32000 об / мин в течение 30 минут 100000 г ).Осадок ресуспендировали в буфере 2: 20 мМ Hepes, 2 мМ DTT (мембранная фракция). Все образцы хранятся при -80 ° C. Концентрации ферментов определяют с помощью анализа Брэдфорда ⁵⁹ .

Фракцию мембранного белка от временной сверхэкспрессии NAPE-PLD в клетках HEK293T разводили до 0,4 мг / мл ^-1 в буфере для анализа: 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 0,02% Triton X-100, 150 мМ NaCl. (Ссылка 60). 10 мМ исходный субстрат PED6 (Invitrogen) последовательно разбавляли в ДМСО (25 ×) и в буфере для анализа (10 ×).Соответствующие концентрации соединений готовят в ДМСО. Анализ проводят в темном 96-луночном планшете Greiner, конечный объем 100 мкл. Соединение или ДМСО инкубируют с лизатом мембранного белка (конечная концентрация 0,04 мг / мл ^-1 ) в течение 30 мин при 37 ° C. Образец без лизата мембранного белка вводят для вычитания фона. Затем добавляется субстрат (конечная концентрация 1 мкМ) и измерение начинается немедленно на TECAN infinite M1000 pro при 37 ° C (возбуждение 485 нм, эмиссия 535 нм), сканирование каждые 2 минуты в течение 1 часа.

Подготовка клеточных культур и мембран для анализа DAGL, MAGL

Клеточная культура и подготовка мембран были выполнены, как описано ранее ⁴³ . Клетки HEK293T (источник: Голландский институт рака) выращивали в среде DMEM со стабильным глутамином и фенолом (PAA), 10% сывороткой новорожденных телят, пенициллином и стрептомицином. Клетки пассировали каждые 2–3 дня путем ресуспендирования в среде и высева их до необходимого слияния. Мембраны получали из временно трансфицированных клеток HEK293T.За сутки до трансфекции 10 ⁷ клеток высевали в 15-сантиметровую чашку Петри. Клетки трансфицировали добавлением смеси 3: 1 полиэтиленимина (60 мкг) и плазмидной ДНК (20 мкг) в 2 мл бессывороточной среды. Среду обновляли через 24 часа, а через 72 часа клетки собирали, суспендировав их в 20 мл среды. Суспензию центрифугировали 10 мин при 1000 об / мин и супернатант удаляли. Осадок клеток хранили при -80 ° C до использования. Осадки клеток размораживали на льду и суспендировали в буфере для лизиса A (20 мМ HEPES, 2 мМ DTT, 0.25 М сахарозы, 1 мМ MgCl ₂ , 25 Ед мкл ^-1 бензоназы). Суспензию гомогенизировали политроном (3 × 7 с) и инкубировали 30 мин на льду. Суспензию подвергали ультрацентрифугированию (100000 × г , 30 мин, 4 ° C, Beckman Coulter, ротор типа Ti70) с получением цитозольной фракции в супернатанте и мембранной фракции в виде осадка. Осадок ресуспендировали в буфере для лизиса B (20 мМ HEPES, 2 мМ DTT). Концентрацию белка определяли с помощью анализа Quick Start Bradford (Biorad).Белковые фракции разбавляли до общей концентрации белка 1 мг / мл ^-1 и хранили в небольших аликвотах при -80 ° C до использования.

Биохимический анализ активности DAGLα

Активность hDAGL-α измеряли по степени гидролиза пара-нитрофенилбутирата (PNP-бутирата) мембранными препаратами из клеток HEK293T (источник: Голландский институт рака), временно трансфицированных hDAGL-α (см. 43). Процент ингибирования контрольных лигандов определяли по сравнению с необработанным контролем.Реакции проводили в 50 мМ буфере HEPES pH 7,2 с 0,05 мкг мкл ^-1 конечной концентрации белка, трансфицированного hDAGL-α.

Биохимический анализ активности MAGL

Активность MAGL измеряли по степени продукции глицерина в результате гидролиза 2-AG мембранными препаратами, сверхэкспрессирующими MAGL, из временно трансфицированных клеток HEK293T (источник: Голландский институт рака) ⁶¹ . Процент ингибирования контрольных лигандов определяли по сравнению с необработанным контролем.Стандартные условия анализа следующие: 0,2 Ед. Мл ^-1 глицеринкиназы (GK), глицерин-3-фосфатоксидазы (GPO) и пероксидазы хрена (HRP), 0,125 мМ АТФ, 10 мкМ AmplifuRed, 5% ДМСО, 25 мкМ. 2-AG и 0,5% ацетонитрил в общем объеме 200 мкл. Флуоресценцию измеряли с 5-минутными интервалами в течение 60 минут.

Активность FAAH

Активность FAAH оценивали с использованием гомогената клеток U937 (источник: клетки U937 были приобретены в ATCC, Манассас, Вирджиния, США). Исследуемые соединения (в концентрациях 1 и 5 мкМ) или растворитель (≤1% от конечного объема) предварительно инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин со 100 мкг гомогената клеток, разведенных в буфере для анализа (10 мМ Tris-HCl и 1 мМ ЭДТА, pH 7.6 и 1% БСА, не содержащего жирных кислот). Затем к гомогенату добавляли смесь 99,5 нМ нМ AEA и 0,5 нМ [этаноламин-1-3H] -AEA (40-60 Ки, ммоль ^-1 ) (конечная концентрация 100 нМ) и инкубировали в течение 10 дней. мин при 37 ° C при встряхивании. По истечении времени инкубации к каждому образцу добавляли 2 объема ледяной смеси метанол: хлороформ 1: 1 (об. / Об.), Интенсивно встряхивали и центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут при 4 ° C для разделения водной и органические фазы. Водные фазы собирали и измеряли радиоактивность, связанную с продуктом гидролиза [3H] -этаноламином, после добавления 3 мл сцинтилляционной смеси с использованием сцинтилляционного счетчика Tri-Carb 2100 TR.Данные были собраны из трех независимых экспериментов, выполненных в трех повторностях, и результаты были выражены как активность FAAH по сравнению с таковой в образцах, обработанных носителем (= 100%).

Активность COX2

Активность COX2 оценивалась с использованием набора для анализа флуоресцентного ингибитора COX от Cayman ChemStation. Анализ выполняли в конечном объеме 50 мкл на 384-луночных не связывающих черных микропланшетах. Исследуемые соединения (при скрининговой концентрации 5 мкМ, 2,5 мкл) или растворитель инкубировали в течение 15 мин при 37 ° C со следующим раствором: 37.5 мкл буфера для анализа (трис-HCl, 100 мМ, pH = 8), 2,5 мкл гема (конечная концентрация 1 мкМ), 2,5 мкл фермента COX-2 и 2,5 мкл 10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазина (ADHP) флуорометрический субстрат (конечная концентрация 30 мкМ). Реакцию начинали добавлением арахидоновой кислоты (AA) или 2-AG (2,5 мкл, конечная концентрация 10 мкМ). Сигналы флуоресценции измеряли после 5 мин инкубации с TECAN FARCyte Ultra (пример 535 нм, Em 580 нм). Ингибитор ЦОГ DuP-697 (1 мкМ) использовали в качестве положительного контроля.Спонтанное неферментативное расщепление ADHP количественно определяли в образцах, в которых СОХ2 был заменен аналитическим буфером. Затем неспецифическое значение вычитали из измеренной флуоресценции. Данные были собраны из трех независимых экспериментов, проведенных в трех повторностях, и результаты были выражены как активность СОХ2 по сравнению с таковой в образцах, обработанных носителем (= 100%).

Активность ABHD6 и ABHD12

Клетки HEK293T были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, Вирджиния, США).Липофектамин 2000 был получен от Life Technologies (Карлсбад, Калифорния, США), а генетицин от InvivoGen. Среда для культивирования клеток, FBS и добавки для культур клеток были от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США). pCMV6-AC-hABHD6 и pCMV6-XL4-hABHD12 были любезным подарком профессора Ярмо Т. Лайтинена. Затем последовательность hABHD12 была вставлена ​​в плазмиду pcDNA3.1 для создания стабильной клеточной линии. Влияние лигандов CB ₂ R на гидролитическую активность ABHD6 и ABHD12 определяли с использованием клеточного гомогената из клеток HEK293T, сверхэкспрессирующих hABHD6 и hABHD12 (40 мкг общего белка на условие).Образцы предварительно инкубировали с соединениями (10 мкМ в скрининговом анализе и концентрации в диапазоне от 1 нМ до 50 мкМ для кривых доза-ответ) в буфере Tris 1 мМ, EDTA 10 мМ (pH = 7,6), содержащем 0,1% ( ж / об) BSA. ДМСО использовали в качестве контроля носителя, а WWL70 10 мкМ или THL 20 мкМ в качестве положительных контролей. Добавляли [ ³ H] -2-OG (конечная концентрация 10 мкМ) и после инкубации в течение 5 минут при 37 ° C реакцию останавливали добавлением 400 мкл охлажденного льдом CHCl ₃ : MeOH ( 1: 1). Образцы встряхивали и центрифугировали (16 100 г 10 мин, 4 ° C).Аликвоты (200 мкл) водной фазы анализировали на содержание трития с помощью жидкостной сцинтилляционной спектроскопии. Значения, полученные для каждого измерения, были скорректированы на неспецифический гидролиз (не опосредованный ABHD6) путем вычитания сигнала, полученного при гидролизе [ ³ H] — 2-OG нетрансфицированным HEK293T.

Профилирование белков в тканях мозга мышей на основе активности

Мышиные ткани выделяли в соответствии с руководящими принципами, одобренными этическим комитетом Лейденского университета (DEC № 13191) (исх.43). Уход за животными, изоляция тканей и следующие экспериментальные процедуры выполнялись в лаборатории Марио ван дер Стельта, Лейденский университет. Ткани мыши гомогенизировали в буфере для лизиса с pH 7,2 (20 мМ Hepes, 2 мМ DTT, 1 мМ MgCl ₂ , 25 ед. Мл ^-1 бензоназы) и инкубировали в течение 5 минут на льду с последующим низкоскоростным вращением (2,500 g , 3 мин, 4 ° C) для удаления мусора. Суспензию подвергали ультрацентрифугированию (100000 г , 45 мин, 4 ° C, Beckman Coulter, ротор типа Ti70) для отделения цитозольной фракции от мембранной фракции.Осадок ресуспендировали в буфере для хранения (20 мМ Hepes, 2 мМ DTT). Концентрацию общего белка определяли с помощью анализа Quick Start Bradford (Biorad) или анализа белка Qubit (Invitrogen). Тканевый протеом (2,5 мг / мл ^-1 ) инкубировали с носителем (ДМСО) или ингибитором в 0,5 мкл ДМСО (конечная концентрация 10 мкМ) в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем инкубировали с ABP широкого спектра действия MB064 (конечная концентрация 250 нМ). или TAMRA-FP (конечная концентрация 500 нМ) в течение 15 мин при комнатной температуре (ссылка 43).Реакции гасили 10 мкл стандартного 3 × SDS-PAGE буфера для образцов. Образцы загружали напрямую (7 мкл = ~ 12 мкг) и разделяли на SDS-страничном геле (10% акриламид). Гели визуализировали и сканировали с помощью Bio-Rad Universal Hood III (Bio-Rad Laboratories B.V.), используя настройки Cy3 / TAMRA (длина волны возбуждения 532 нм, длина волны излучения 580 нм).

Нецелевая активность на каналах TRP

Клетки HEK293 (эмбриональная почка человека), стабильно сверхэкспрессирующие рекомбинантный человеческий TRPV1 или крысиный TRPA1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 или TRPM8 (источник: клетки эмбриональной почки человека были приобретены DSMZ (Германия)) , Клетки TRPV1-HEK-293 были любезным подарком от Джона Дэвиса, GlaxoSmithKline, Харлоу, Великобритания, плазмида для TRPV2, а также TRPV3-HEK-293 и TRPV4-HEK-293 были любезным подарком от HB Bradshaw Indiana University, плазмида, содержащая TRPA1, была любезным подарком Свена-Эрика Джордта, работавшего тогда на факультете клеточной и молекулярной фармакологии Калифорнийского университета, Сан-Франциско, Калифорния, США, а теперь на факультете анестезиологии Медицинской школы Университета Дьюка, Дарем, Северная Каролина, США, TRPM8-HEK-293 был подарком Марио ван дер Стелта) были выращены на чашках Петри диаметром 100 мм в виде монослоев в минимально необходимой среде с добавлением заменимых аминокислот, 10% FBS, 2 мМ глутамина и поддерживались на уровне 5. % CO ₂ при 37 ° C.Количественный анализ в реальном времени проводили для измерения сверхэкспрессии гена TRP в трансфицированных клетках (данные не показаны). В день эксперимента клетки загружали метиловым эфиром Fluo-4 AM в минимально необходимой среде (4 мкМ в ДМСО, содержащем 0,02% Pluronic F-127, Invitrogen), выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 1 часа, промывали. дважды с буфером Тирода (145 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,5 мМ CaCl ₂ , 1,2 мМ MgCl ₂ , 10 мМ D-глюкозы и 10 мМ HEPES, pH 7,4), ресуспендировали в том же буфере и переносили ( около 100000 ячеек) в кварцевую кювету спектрофлуориметра (Perkin-Elmer LS50B, оснащенный флуоресцентной системой Пельтье PTP-1; PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Уолтем, Массачусетс, США) при непрерывном перемешивании.Влияние на внутриклеточную концентрацию Ca ²⁺ ([Ca ²⁺ ] _i ) до и после добавления различных концентраций тестируемых соединений измеряли по флуоресценции клеток (λ _EX = 488 нм, λ _EM. = 516 нм) при 25 ° C. Эффекты соединений были нормализованы по отношению к ответу на иономицин (4 мкМ) в каждом эксперименте. Увеличение флуоресценции клеток HEK293 дикого типа (то есть не трансфицированных какой-либо конструкцией) использовали в качестве исходного уровня и вычитали из значений, полученных для трансфицированных клеток.Эффективность определялась как максимальный ответ, вызываемый тестируемыми соединениями, и определялась путем сравнения их эффекта с аналогичным эффектом, наблюдаемым с 4 мкМ иономицином (Cayman), в то время как эффективность соединений (EC ₅₀ ) определялась как требуемая концентрация. для получения полумаксимального увеличения [Ca ²⁺ ] _i . Аппроксимация кривой (наклон сигмоидальной переменной доза-ответ) и оценка параметров выполнялись с помощью GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США).

Антагонистическое / десенсибилизирующее поведение оценивали путем добавления тестируемых соединений в кварцевую кювету за 5 минут до стимуляции клеток агонистами. В случае человеческих TRPV1-экспрессирующих клеток HEK293 в качестве агониста использовался капсаицин (0,1 мкМ, в случае SR141716A также использовалось 10 нМ), который был способен повышать внутриклеточный Ca ²⁺ с эффективностью EC ₅₀ = 5,3 ± 0,4 нМ и эффективность = 78,6 ± 0,6%.

Для TRPV2 клетки TRPV2-HEK293 крысы показали резкое увеличение [Ca ²⁺ ] _i при нанесении 3 мкМ лизофосфатидилхолина (LPC).Концентрация для полумаксимальной активации составляла 3,40 ± 0,02 мкМ, а эффективность составляла 91,7 ± 0,5%.

В случае TRPV3 крысиные TRPV3-экспрессирующие клетки HEK-293 сначала сенсибилизировали неселективным агонистом 2-аминоэтоксидифенилборатом (100 мкМ). Антагонистическое / десенсибилизирующее поведение оценивали в отношении тимола (100 мкМ), который показал эффективность 34,7 ± 0,2% и эффективность EC ₅₀ = 84,1 ± 1,6 мкМ.

В случае крысиных TRPV4-экспрессирующих клеток HEK-293 в качестве агониста использовался 4α-форбол 12,13-дидеканоат (4α-PDD) (1 мкМ), который был способен повышать внутриклеточный Ca ²⁺ с эффективностью. EC ₅₀ = 0.46 ± 0,07 мкМ и эффективность 51,9 ± 1,7%.

В случае крысиных TRPM8-экспрессирующих клеток HEK-293 антагонистическое / десенсибилизирующее поведение оценивали по отношению к ицилину при 0,25 мкМ и 0,10 мкМ. Для ицилина эффективность составила 75,1 ± 1,1, а эффективность EC ₅₀ = 0,11 ± 0,01 мкМ.

В случае клеток HEK-293, стабильно сверхэкспрессирующих рекомбинантный крысиный TRPA1, эффекты агонистов TRPA1 выражаются в процентах от эффекта, полученного с использованием 100 мкМ аллилизотиоцианата, эффективность которого составляет EC ₅₀ = 1.41 ± 0,04 мкМ и эффективность 65,9 ± 0,5.

Эффект на [Ca ²⁺ ] _i , оказываемый одним агонистом, был принят за 100%. Данные выражены в виде концентрации, оказывающей полумаксимальное ингибирование индуцированного агонистом повышения [Ca ²⁺ ] _i (IC ₅₀ ), которую снова рассчитали с использованием GraphPad. Все определения выполняли как минимум в трех экземплярах. Статистический анализ данных был выполнен путем дисперсионного анализа в каждой точке с использованием ANOVA с последующим тестом Бонферрони.

Панель CEREP

Были созданы фармакологические профили тестируемых соединений. Представленные данные дают процент ингибирования для анализов связывания и процент ингибирования для ферментативных и клеточных анализов при тестовой концентрации 10 мкМ. Анализы проводили в CEREP в соответствии со стандартными процедурами, описанными на http://www.cerep.fr/cerep/users/index.asp. Для первых оцениваемых соединений (WIN55212-2, CP55940, SR141716A, JWh233, HU308, Gp-1a и HU910) применялись стандартные профили, предложенные CEREP.Для других соединений использовались уменьшенные панели, концентрируясь на большинстве прогнозируемых противодействий и исключая редко поражаемые участки.

Клиренс микросом

Для человека или мышей использовали объединенные коммерчески доступные препараты микросом из тканей печени (источник: объединенные микросомы человека (BD UltraPool HLM 150, лот 38289) и объединенные микросомы мышей-самцов (C57BL / 6J, лот 4339006). приобретено у Corning Incorporated (Уоберн, США)) ⁶² . Для человека приобретаются сверхобъединенные (150 доноров смешанного пола) микросомы печени для учета биологической дисперсии in vivo .Для инкубации микросом применяют 96-луночные планшеты с глубокими лунками, которые инкубируют при 37 ° C на TECAN (Tecan Group Ltd, Швейцария), оборудованном встряхивателями Te-Shake и устройством для подогрева (Tecan Group Ltd, Швейцария). Буфер для инкубации представляет собой 0,1 М фосфатный буфер при pH 7,4. Система регенерации НАДФН состоит из 30 мМ гидрата динатриевой соли глюкозо-6-фосфата; 10 мМ НАДФ; 30 мМ MgCl ₂ × 6 H ₂ O и 5 мг мл ^-1 глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Roche Diagnostics) в 0.1 М калий-фосфатный буфер pH 7,4.

Инкубации тестируемого соединения в концентрации 1 мкМ в микросомных инкубациях 0,5 мг / мл ^-1 плюс кофактор НАДФН проводят в 96-луночных планшетах при 37 ° C. Через 1, 3, 6, 9, 15, 25, 35 и 45 минут 40 мкл инкубационных растворов переносят и гасят ацетонитрилом 3: 1 (об. / Об.), Содержащим внутренние стандарты. Затем образцы охлаждают и центрифугируют перед анализом методом ЖХ-МС / МС.

Логарифмические отношения площадей пиков (площадь пика тестируемого соединения / площадь пика внутреннего стандарта) наносят на график в зависимости от времени инкубации с использованием линейной аппроксимации.Рассчитанный наклон используется для определения внутреннего клиренса: Клинт (мкл мин ^-1 на мг белка) = — наклон (мин-1) × 1000 / [концентрация белка (мг / мл) ^-1 ]. Данные получены из одиночных экспериментов, измеренных в несколько временных точек.

Клиренс гепатоцитов

Для животных суспензионные культуры гепатоцитов либо свежеприготовленные с помощью исследований перфузии печени, либо из партий криоконсервированных гепатоцитов ⁶³ . Для человека в основном используются коммерчески доступные объединенные (5–20 доноров) криоконсервированные гепатоциты человека из нетрансплантируемых тканей печени (источник: первичные объединенные криоконсервированные гепатоциты человека (Lot ECO) из нетрансплантируемых тканей печени и объединенные гепатоциты мыши C57BL6 (Lot PJJ) были приобретены в BioreclamationIVT (Нью-Йорк, США)).Для суспензионных культур используют планшеты Nunc U96 PP-0,5 мл (Nunc Natural, 267245), которые инкубируют в инкубаторе Thermo Forma от Fischer Scientific (Волен, Швейцария), оборудованном шейкерами от Variomag Teleshake shakers (Sterico, Wangen, Швейцария). ) для поддержания клеточной дисперсии. Среда для культивирования клеток представляет собой среду Уильяма с добавлением глутамина, антибиотиков, инсулина, дексаметазона и 10% FCS.

Инкубации тестируемого соединения при тестовой концентрации 1 мкМ в суспензионных культурах 1 млн клеток ^-1 мл (~ 1 мг / мл ^{-1 концентрация белка} ) проводят в 96-луночных планшетах и ​​встряхивают при 900 об / мин до до 2 часов в атмосфере 5% CO ₂ и температуре 37 ° C.Через 3, 6, 10, 20, 40, 60 и 120 минут 100 мкл клеточной суспензии в каждой лунке гасят 200 мкл метанола, содержащего внутренний стандарт. Затем образцы охлаждают и центрифугируют перед анализом методом ЖХ-МС / МС.

Логарифмические отношения площадей пиков (площадь пика тестируемого соединения / площадь пика внутреннего стандарта) или концентрации наносят на график в зависимости от времени инкубации и проводят линейную аппроксимацию данных с акцентом на начальной скорости исчезновения соединения. Затем наклон аппроксимации используется для расчета внутреннего зазора: Клинт (мкл мин ^-1 1 ^-1 × 106 ячеек) = — наклон (мин-1) × 1000 / [1 × 106 ячеек].Данные получены из одиночных экспериментов, измеренных в несколько временных точек.

Связывание с белками плазмы

Объединенная и замороженная плазма отобранных видов была получена от коммерческих поставщиков (объединенная и замороженная плазма от человека (HMPLEDTA, Lot BRh2060627) и мыши (MSEPLEDTA3-C57, Lot MSE196204) была получена от BioreclamationIVT (NY, США).) ^64,65 . Тефлоновый равновесный диализный планшет (96-луночный, 150 мкл, наполовину емкость ячейки) и целлюлозные мембраны (отсечка молекулярной массы 12–14 кДа) были приобретены в HT-Dialysis (Gales Ferry, CT, США).PH как биологической матрицы, так и фосфатного буфера доводят до 7,4 в день эксперимента. Стандартное вещество — диазепам.

Определение несвязанного соединения проводят с использованием 96-луночного устройства для уравновешивания диализа с мембраной с отсечкой по молекулярной массе 12-14 кДа. Само устройство для уравновешивания диализа изготовлено из тефлона, чтобы минимизировать неспецифическое связывание исследуемого вещества. Соединения тестируют в кассетах по 2–5 с начальной общей концентрацией 1000 нМ, причем одно из кассетных соединений является диазепамом положительного контроля.

Равные объемы образцов матрикса, содержащих вещества и холостой диализный буфер (буфер Зуренсена при pH 7,4), загружают в противоположные отсеки каждой лунки. Блок диализа герметично закрывают и выдерживают в течение 5 ч при температуре 37 ° C и 5% CO ₂ окружающей среды в инкубаторе. По истечении этого времени равновесие будет достигнуто для большинства низкомолекулярных соединений с молекулярной массой <600. Затем пломба удаляется, и матрица и буфер после каждого диализа готовятся для анализа с помощью ЖХ-МС / МС.Все определения связывания с белками проводят в трех экземплярах. Целостность мембран проверяется на устройстве HTDialysis путем определения значений несвязанной фракции для положительного контроля диазепама в каждой лунке.

В состоянии равновесия концентрация несвязанного лекарственного средства в отсеке биологической матрицы устройства для уравновешенного диализа такая же, как и концентрация соединения в буферном отсеке. Таким образом, процент несвязанной фракции (fu) можно рассчитать путем определения концентраций соединения в отсеках буфера и матрицы после диализа следующим образом:% fu = 100 × концентрация буфера после диализа / концентрация матрицы после диализа.Восстановление устройства проверяют путем измерения концентраций соединений в матрице перед диализом и вычисления процента восстановления (массового баланса). Для принятия данных восстановление должно быть в пределах 80-120%.

Связывание P-гликопротеина

P-гликопротеин (гликопротеин проницаемости, сокращенно «P-gp», также известный как белок 1 множественной лекарственной устойчивости (MDR1)) является наиболее изученным и наиболее охарактеризованным переносчиком лекарственных средств. Анализ P-gp оценивает способность тестируемых соединений переноситься трансцеллюлярно в виде субстрата P-gp ⁶⁶ .В анализе используются трансфицированные клетки LLC-PK1 (эпителиальные клетки почек свиньи, полученные из Нидерландского института рака), экспрессирующие человеческий или мышиный P-gp, культивируемые на 96-луночных полупроницаемых фильтрующих мембранных планшетах, где они образуют поляризованный монослой с плотными контактами. , и действуют как барьер между апикальным и базолатеральным компартментами. P-gp экспрессируется в обращенной к верхушке мембране монослоя (герметичность подтверждена с помощью желтого люцифера). Для тестирования субстрата анализ определяет однонаправленную проницаемость (Papp) тестируемого соединения путем раздельного дозирования на апикальную (для A> B Papp) и базолатеральную (для B> A Papp) стороны монослоя клеток (то есть в донорские компартменты). и измерение перемещения соединения в соответствующие отсеки-приемники в течение 3 ч инкубации при 37 ° C.Эффект P-gp измеряется путем выражения коэффициента оттока (ER) однонаправленных значений Papp A> B и B> A. Средняя проницаемость (A> B и B> A Papp) определяется в отсутствие P-gp путем добавления селективного ингибитора зосуквидара в концентрации 1 мкМ. Затем ER и среднее значение Papp используются для классификации свойств соединений в зависимости от степени их истечения и проницаемости.

PAMPA

PAMPA (анализ параллельной искусственной мембранной проницаемости) — это метод, который определяет проницаемость веществ из донорского отсека через искусственную мембрану с липидами в акцепторный отсек.Считывание представляет собой коэффициент проницаемости Peff лекарственного средства, а также концентрации тестируемого соединения в донорском, мембранном и акцепторном отсеках ⁶⁷ .

96-луночный планшет для микротитрования, полностью заполненный водными буферными растворами (pH 7,4 / 6,5), покрыт планшетом для микротитрования, как сэндвич-конструкция. Гидрофобный фильтрующий материал (Durapore / Millipore; размер пор 0,22–0,45 мкм) первых 48 лунок (образец) фильтровального планшета пропитывают 1–20% раствором лецитина в органическом растворителе (додекан, гексадекан, 1,9 -декадиен).Поверхность фильтра остальных 48 лунок (контрольных) смачивают небольшим объемом (4–5 мкл) 50% (об. / Об.) Раствора метанол / буфер. Исследования переноса начинали с переноса 100–200 мкл исходного раствора 250 или 500 мкМ на фильтровальную пластину в образце и в контрольную секцию, соответственно. Обычно использовали 0,05 М трис, pH 7,4 или 0,05 М фосфат, pH 6,5, буферы. Максимальное содержание ДМСО в исходных растворах составляло 5%.

Кинетическая растворимость

Растворимость тестируемого соединения в фосфатном буфере при pH 6.5 из выпаренного исходного раствора соединения ДМСО измеряется с течением времени, что приводит к кинетической растворимости соединений.

Триадный анализ на мышах с использованием процедуры кумулятивного дозирования

Эти эксперименты на животных проводились в лаборатории профессора Лихтмана, Университет Содружества Вирджинии. Самцы мышей C57BL6 / J были приобретены в Jackson Laboratories (Бар-Харбор, штат Мэн, США), и во время лечения им было от 10 до 12 недель. Протокол на животных для триадного анализа был одобрен Комитетом по уходу и использованию институциональных животных Университета Содружества Вирджинии в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных ⁶⁸ .После завершения тестирования все мыши были гуманно умерщвлены посредством асфиксии CO ₂ с последующим быстрым смещением шейных позвонков. Обо всех исследованиях с участием животных сообщается в соответствии с руководящими принципами ARRIVE по отчетности об экспериментах с животными ⁶⁹ . ⁷⁰ .Перед введением дозы проводили базовые измерения каталепсии, антиноцицепции и гипотермии, и мышам вводили носитель, состоящий из 1 части этанола, 1 части эмульфора Alkumus-620 и 18 частей 0,9% физиологического раствора. Через 30 минут после инъекции мышей снова оценивали на каталепсию, антиноцицепцию и гипотермию, что потребовало 10 минут для тестирования всех мышей. Этот процесс был повторен с использованием кумулятивных доз HU210 (0,03–3,0 мг / кг ^–1 ), HU308 (1–100 мг / кг ^–1 ), HU910 (1–100 мг / кг ^–1 ) и JWh233 ( 1–100 мг кг ^-1 ) с шагом в половину логарифма, так что мышам вводили каждые 40 минут и тестировали через 30 минут после каждой инъекции до конца сеанса тестирования.Для каждого из четырех препаратов использовали отдельные группы мышей ( n = 8). Все инъекции делали внутрибрюшинным (i.p.) путем введения в объеме 10 мкл на 1 г массы тела.

Для экспериментов по антагонизму мышей из экспериментов по кумулятивному дозированию HU308, HU910 и JWh233 снова использовали (после периода вымывания в течение 1 недели), чтобы оценить, будет ли HU910 (30 мг / кг ^-1 ) противодействовать каннабимиметическим эффектам ED ₈₄ доза HU210.Для сравнения был проведен отдельный эксперимент с использованием антагониста рецептора CB ₁ / обратного агониста римонабанта (3 мг / кг ^-1 ). В каждом из этих двух экспериментов по оценке антагонизма мышей были равномерно распределены в отношении истории приема лекарств по группам лечения. Исходные ответы оценивались перед инъекциями. Субъекты в каждом эксперименте получали i.p. инъекция носителя или соответствующего антагониста рецептора через 0 мин, вторая внутрибрюшинная инъекция. впрыск автомобиля или HU210 (1.7 мг / кг ^-1 , что отражало приблизительное значение ED ₈₄ при возникновении антиноцицепции и гипотермии) через 40 мин. Через 30 мин после каждой инъекции мышей проверяли на каталепсию, антиноцицепцию и гипотермию.

Данные исследований доза-ответ анализировали с помощью однофакторного анализа ANOVA с повторными измерениями с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с носителем). Значения ED ₅₀ и ED ₈₄ определяли с помощью линейной регрессии для лекарств, вызывающих максимальные эффекты для данной конечной точки.Данные экспериментов по антагонизму анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа, в котором факторы были антагонистами по сравнению с носителем и HU210 по сравнению с носителем. Post hoc анализ был проведен с использованием теста Холма-Сидака. P Значения <0,05 были определены как значимые.

Фармакокинетические исследования in vivo

Самцы мышей C57BL / 6J были получены от CRL-F (Charles River, Франция), самцы крыс Wistar были получены от RCC Füllinsdorf, а самцы мышей C57BL / 6JRj были от Janvier (Франция).Возраст животных был до 12 недель. Все исследования на животных в этом разделе проводились в Hoffmann-La Roche и одобрены Bundesamt für Lebensmittelsicherheit und Veterinärwesen (BLV) der Schweizerischen Eidgenossenschaft. Тестируемые соединения были составлены согласно соответствующим протоколам либо путем растворения (iv), либо в стеклянной посуде до достижения гомогенности (перорально) (составы для перорального введения: JWh233 и HU308 были приготовлены в виде микросуспензии в желатине / NaCl (7,5 / 0,62%). в воде, и HU910 был приготовлен в виде раствора в этаноле / кремофоре EL / NaCl 0.9% (5/5/90%)). Составы вводили внутривенно. с помощью иглы 30G в боковой хвостовой вене мышей, используя объем 50 мкл в указанной дозе. Для п.о. аппликации животным вводили через зонд в объеме 100 мкл в указанной дозе. В следующие моменты времени кровь брали на ЭДТА: 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 7 ч (для перорального введения первая временная точка была опущена). Для каждого эксперимента с соединением in vivo использовали шесть животных. Животных распределяли случайным образом по времени, и в каждый момент времени брали объем 100 мкл крови.Количественное измерение соединения в плазме проводили с помощью анализа ЖХ-МС / МС. Фармакокинетический анализ выполняли с использованием программного обеспечения Phoenix WinNonlin 6.4 с использованием некомпартментного подхода, соответствующего пути введения. Для оценки воздействия Cmax, Tmax и AUC определяли из профилей концентрации в сыворотке. Параметры (CL по сравнению с T1 / 2) оценивали с использованием номинального времени отбора проб относительно начала каждого введения. CO экстраполировали из первой концентрации, измеренной после внутривенного введения.

Доступность данных

Данные, подтверждающие выводы этого исследования, включены в опубликованную статью и дополнительную информацию к ней или доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

705 Противоопухолевая активность CB-668, мощного, селективного и перорально биодоступного низкомолекулярного ингибитора иммуносупрессивного фермента, индуцированного интерлейкином 4 (IL-4) гена 1 (IL4I1)

Abstract

Предпосылки Опухоли уклоняются от разрушения иммунной системой с помощью нескольких механизмов, включая изменение метаболизма в микроокружении опухоли.Метаболический контроль иммунных ответов происходит за счет истощения основных питательных веществ или накопления токсичных метаболитов, которые ухудшают функцию иммунных клеток и способствуют росту опухоли. Секретируемый фермент, индуцированный интерлейкином 4 (IL-4), ген 1 (IL4I1) представляет собой L-фенилаланиноксидазу, которая катаболизирует фенилаланин и продуцирует фенилпируват и перекись водорода. IL4I1 регулирует несколько аспектов адаптивного иммунитета у мышей, в том числе ингибирование цитотоксических Т-клеток за счет выработки пероксида водорода (обзор ^-1 ).В опухолях человека экспрессия IL4I1 значительно повышена по сравнению с нормальными тканями и особенно высока в опухолях яичников и В-клеточных лимфомах. Руководствуясь гипотезой о том, что IL4I1 является иммунометаболическим ферментом, подавляющим противоопухолевый иммунитет, мы открыли CB-668, первый известный низкомолекулярный ингибитор IL4I1.

Методы Ферментативную активность IL4I1 измеряли с использованием ферментного анализа, сопряженного с HRP. Гибридизацию РНК in-situ проводили на платформе RNAScope.Сингенные модели опухолей мышей использовали для оценки противоопухолевой активности CB-668. Уровень фенилпирувата в гомогенатах опухолей измеряли с помощью ЖХ / МС.

Результаты Наш клинический кандидат CB-668 является мощным и селективным неконкурентным ингибитором IL4I1 (IC ₅₀ = 15 нМ). CB-668 обладает благоприятными свойствами ADME in vitro и показал низкий клиренс и высокую биодоступность при пероральном введении у грызунов. Дважды в день пероральное введение CB-668 хорошо переносилось мышами и приводило к противоопухолевой активности одного агента в сингенных моделях опухолей мышей B16-F10, A20 и EG7.Пероральное введение CB-668 снижает уровни фенилпирувата в опухоли, что согласуется с ингибированием ферментативной активности IL4I1. Противоопухолевая активность CB-668 была опосредована иммунными клетками, поскольку эффективность была отменена у мышей с истощенным CD8, а обработка CB-668 вызвала повышенную экспрессию провоспалительных иммунных генов в опухоли. Более того, CB-668 не обладал прямой антипролиферативной активностью в отношении опухолевых клеток, выращенных in vitro (IC ₅₀ > 50 мкМ). CB-668 также выгодно комбинируется с терапией против PD-L1 для уменьшения роста опухоли в модели опухоли B16-F10.

Выводы Эти данные подтверждают иммуноопосредованный противоопухолевый эффект ингибирования IL4I1 CB-668 и предполагают, что ингибирование IL4I1 представляет собой новую стратегию иммунотерапии рака.

Ссылка

1. Молинье-Френкель В., Прево-Блондель А. и Кастеллано Ф. Фермент IL4I1: новый игрок в иммуносупрессивной микросреде опухолей. Ячейки 2019; 8 : 1–9.

http: // creativecommons.org / licenses / by-nc / 4.0 /

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution 4.0 Unported (CC BY 4.0), которая позволяет другим копировать, распространять, ремикшировать, преобразовывать и строить на основе этой работы. для любых целей, при условии правильного цитирования оригинальной работы, дается ссылка на лицензию и указывается, были ли внесены изменения. См. Https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Число увольнений единорогов из сферы здравоохранения достигло рекордных уровней в 2020 г.

Наша временная шкала визуализирует уход 20 медицинских компаний с оценкой более 1 млрд долларов по сравнению с 12 долларами у GoodRx.Открытое размещение акций 7B в связи с массовым приобретением компанией Illumina GRAIL.

Во всем мире существует 51 медицинский единорог (частная компания, оцененная в более чем 1 миллиард долларов), совокупная стоимость которых составляет 118,1 миллиарда долларов (по состоянию на 3/3/21).

По мере развития этих компаний количество выходов единорогов из сферы здравоохранения, оцениваемых в $ 1 млрд +, также выросло: 55% от общего числа выходов группы произошло с 2020 года. Уже в 2021 году такие единороги, как 23andMe, объявили о своем уходе.

Ниже мы анализируем недавний всплеск активности выхода единорогов из сферы здравоохранения и его значение для будущего отрасли здравоохранения.

Нажмите, чтобы увеличить.

ЧТО НУЖНО ЗНАТЬ:

• В 2020 году активность единорогов в сфере здравоохранения достигла рекордного уровня. В 2020 году ушли 7 медицинских единорогов — явный рост по сравнению с двумя выходами в 2018 году и 4 в 2019 году. ), биофармацевтической компании CureVac (август 2020 г.) и стартапа жидкой биопсии рака GRAIL (сентябрь 2020 г.).
• А вот и SPAC для здравоохранения: Поскольку Covid-19 создал неопределенность на публичных рынках, в 2020 году наблюдался всплеск формирования компаний по приобретению специального назначения (SPAC) — подставных корпораций с «пустым чеком», предназначенных для вывода компаний на биржу без прохождения длительного периода. традиционный процесс IPO. С 2020 года 5 медицинских единорогов поздней стадии (серия D +), включая Butterfly Network, 23andMe и Hims, смотрели на SPAC как на способ выхода на рынок с потенциальной выгодой более быстрого и надежного пути выхода.
• Инвесторы Healthcare Smart Money видят значительную рентабельность инвестиций: Венчурные инвесторы Healthcare Smart Money вошли в пятерку из 10 крупнейших инвесторов в медицинские единороги по количеству уникальных сделок с 2015 по 2021 год с начала года (3/3/21). Примеры включают General Catalyst, Sequoia Capital China и Venrock. Эти инвесторы получили значительную окупаемость инвестиций (ROI) от своих ставок на единорогов, таких как 10X Genomics и Oscar Health.

ЧТО ДАЛЬШЕ?

• Ожидается, что в ближайшем будущем будет больше выходов единорогов из сферы здравоохранения: Учитывая, что 67% нынешних единорогов здравоохранения находятся на поздней стадии, мы можем увидеть больше выходов, поскольку эти компании стремятся привлечь капитал от государственных инвесторов.В целом, на более широком рынке медицинских технологий существует множество зрелых компаний, инвесторы которых ищут выхода.
• 2021 год может стать годом SPAC для здравоохранения: С учетом того, что около 53 SPAC активно ищут целевые компании в отраслях здравоохранения и биологических наук, согласно SPAC Track, в течение 2021 года мы можем увидеть, что больше стартапов решат стать публичными по этому пути выхода.

---

Этот отчет был создан на основе данных платформы CB Insights для анализа новых технологий, которая предлагает ясность в отношении появляющихся технологий и новых бизнес-стратегий с помощью таких инструментов, как: Если вы еще не являетесь клиентом, подпишитесь на бесплатную пробную версию, чтобы узнать больше о нашей платформе.

Каннабиноидный агонист CB-13 вызывает периферически опосредованную анальгезию у мышей, но вызывает толерантность и признаки активности ЦНС при повторном дозировании. боль; однако задействование центральных рецепторов CB

₁ сопровождается нежелательными побочными эффектами, такими как толерантность и зависимость. Усилия по разработке новых анальгетиков были сосредоточены на воздействии на периферические рецепторы CB ₁ , чтобы обойти центральные побочные эффекты, связанные с CB ₁ .В настоящем исследовании мы оценили эффекты однократного и повторного дозирования периферически селективного CB ₁ агониста CB-13 на ноцицепцию и центральные фенотипы, связанные с CB ₁ , на воспалительной модели боли у мышей. Мы также оценили клеточные механизмы, лежащие в основе CB-13-индуцированной антиноцицепции in vitro , используя культивированные нейроны ганглия задних корешков (DRG) мыши. CB-13 уменьшал вызванную воспалением механическую аллодинию в зависимости от периферических рецепторов CB ₁ и снимал воспалительную тепловую гипералгезию.В культивируемых DRG нейронах мыши CB-13 снижает сенсибилизацию TRPV1 и повышенную возбудимость нейронов, вызванную воспалительным медиатором простагландином E2, обеспечивая потенциальные механистические объяснения обезболивающего действия периферической активации рецептора CB ₁ . При остром дозировании фенотипы, связанные с активацией центрального рецептора CB ₁ , наблюдались только при дозе CB-13, примерно в 10 раз превышающей ED ₅₀ для снижения аллодинии. Поразительно, что повторное дозирование приводило как к толерантности к анальгетикам, так и к рецепторной зависимости CB ₁ , даже в дозе, которая не вызывала центральных фенотипов, опосредованных рецептором CB ₁ , при остром дозировании.Это предполагает, что повторное введение CB-13 приводит к увеличению воздействия на ЦНС и нежелательному взаимодействию центральных рецепторов CB ₁ . Таким образом, следует соблюдать осторожность в отношении терапевтического использования CB-13 с целью предотвращения побочных эффектов со стороны ЦНС. Тем не менее, явный обезболивающий эффект острой периферической активации рецептора CB ₁ предполагает, что периферически ограниченные каннабиноиды являются жизнеспособной мишенью для разработки новых анальгетиков.

Заявление о конкурирующем интересе

Авторы заявили об отсутствии конкурирующего интереса.

Cb Defense: Как собрать выходные данные от деятельности Mo …

• Датчик защиты Cb: все поддерживаемые версии
• Веб-консоль Cb Defense: все поддерживаемые версии
• Mac OS: все поддерживаемые версии

• Инструкции по получению образца из монитора активности

1. Запустить монитор активности
2. Монитор активности — это приложение, которое предоставляет статистическую и диагностическую информацию для приложений, которые в настоящее время работают

   . Есть два способа запустить Activity Monitor
   — Applications> Utilities> найти (и запустить) Activity Monitor
   — Spotlight найдите Activity Monitor и выберите Activity Monitor из списка результатов

3. Воспроизвести поведение
4. В приложении, с которым вы сообщаете о проблемах, попытайтесь воспроизвести поведение
5. Соберите информацию из монитора активности
6. После воспроизведения поведения вернитесь в монитор активности
7. В в списке процессов найдите имя приложения, которое вы воспроизвели поведение в (той, с которой вы испытываете трудности), ища его имя в столбце Имя процесса
8. После выбора приложения в списке процессов нажмите кнопку Образец процесса на панели инструментов
9. В Activity Monitor один раз образец завершен, нажмите кнопку «Сохранить» в правом верхнем углу окна образца.
10. Сохраните полученный файл и прикрепите его к запросу в службу поддержки или загрузите его в Cb Vault и сообщите владельцу вашего дела, что он там есть

Как правило, довольно легко найти процесс в Activity Monitor.В ситуациях, когда процесс не бросается в глаза, стоит отметить три вещи, которые потенциально могут помочь упростить процесс:

• Убедитесь, что в селекторе «Показать» выбрано «Мои процессы» . Это ограничит список отображаемых приложений. Селектор «Показать» расположен в правой части панели инструментов, слева от поля поиска.
• Отсортировать список процессов по имени . Если процессы отсортированы в алфавитном порядке, должно быть легко найти конкретное приложение, указав его в алфавитном списке процессов.Чтобы отсортировать процессы по имени процесса, щелкните заголовок столбца «Имя процесса» вверху списка.
• Обратите внимание, что процессы, которые в данный момент не отвечают, отображаются красным цветом . Если приложение зависло (оно не реагирует на ввод пользователя или не отображает указатель мыши в виде радужного шарика / вертушки), процесс должен отображаться в Activity Monitor с его именем в красный .

Cb Defense: как собирать журналы монитора процесса при возникновении проблемы (Windows)

Cb Defense: проблемы Mac

Calithera Biosciences, Inc.| Calithera Biosciences представляет новые доклинические данные для CB-668 на ежегодном собрании Общества иммунотерапии рака (SITC) 2020

Ингибитор IL4I1 проявляет иммуноопосредованную противоопухолевую активность

ЮЖНЫЙ САН-ФРАНЦИСКО, Калифорния, 9 ноября 2020 г. (ГЛОБАЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ) — Calithera Biosciences, Inc. (Nasdaq: CALA), биотехнологическая компания, работающая на клинической стадии, сосредоточенная на открытии и разработке новых низкомолекулярных препаратов для лечения рака и других заболеваний. другие опасные для жизни заболевания, объявили, что новые доклинические данные для нового ингибитора IL4I1 CB-668 компании будут представлены на виртуальном ежегодном собрании Общества иммунотерапии рака (SITC) 2020.

CB-668 — мощный селективный низкомолекулярный пероральный ингибитор IL4I1, аминокислотной оксидазы, которая подавляет противоопухолевый иммунитет и способствует росту опухоли. IL4I1 регулирует несколько аспектов адаптивного иммунитета, включая ингибирование цитотоксических Т-клеток за счет выработки как перекиси водорода, так и активаторов арилуглеводородного рецептора. CB-668 увеличивает экспрессию провоспалительных генов в опухолях, что приводит к противоопухолевому эффекту на моделях опухолей мышей. Компания Calithera выбрала CB-668 в качестве клинического кандидата, и в настоящее время продолжаются исследования по поддержке IND.

«Мы рады поделиться этими новыми доклиническими данными о CB-668, который является первым разрабатываемым соединением, предназначенным для воздействия на IL4I1», — сказала Сьюзан Молино, доктор философии, президент и главный исполнительный директор Calithera. «Учитывая сверхэкспрессию IL4I1 в человеческих опухолях, особенно опухолях яичников и В-клеточных лимфомах, CB-668 может обеспечить новый терапевтический подход к различным типам рака».

Доклинические данные представлены Эндрю Маккинноном, доктором философии., демонстрируют, что CB-668 является мощным и селективным ингибитором IL4I1, проявляющим иммуноопосредованную активность единственного агента на моделях сингенных опухолей мышей. CB-668 хорошо переносился в эффективных дозах в исследованиях на животных. Кроме того, CB-668 усиливает ингибиторы контрольных точек в этих моделях.

Название: Противоопухолевая активность CB-668, мощного, селективного и перорально биодоступного низкомолекулярного ингибитора иммуносупрессивного фермента, индуцированного интерлейкином 4 (IL-4) гена 1 (IL4I1)
Abstract: # 506
Расположение: Виртуальный зал плакатов SITC
Дата и время: 11-14 ноября 2020 г., 9:00 а.м.-17:00 ET

Дополнительную информацию о встрече можно найти на веб-сайте SITC www.sitcancer.org. Стендовая презентация CB-668 будет доступна на сайте www.calithera.com на странице публикаций, начиная с 11 ноября ^-го .

О компании Calithera

Calithera Biosciences — биофармацевтическая компания, работающая на клинической стадии, являющаяся пионером в открытии и разработке целевых методов лечения, которые нарушают клеточные метаболические пути, преимущественно блокируя опухолевые клетки и повышая активность иммунных клеток.Руководствуясь приверженностью строгой науке и страстью к улучшению жизни людей, страдающих от рака и других опасных для жизни заболеваний, Calithera продвигает линейку пероральных терапевтических средств, впервые попадающих в клинику, для значительного расширения возможностей лечения, доступных пациентам. Штаб-квартира Calithera находится в Южном Сан-Франциско, Калифорния. Для получения дополнительной информации о Calithera посетите сайт www.calithera.com.

Заявления прогнозного характера

Заявления, содержащиеся в этом пресс-релизе по вопросам, не являющимся историческими фактами, являются «прогнозными заявлениями» по смыслу Закона о реформе судебных разбирательств по частным ценным бумагам 1995 года.Такие слова, как «может», «будет», «ожидать», «ожидать», «оценить», «намереваться», «уравновешенный» и аналогичные выражения (а также другие слова или выражения, относящиеся к будущим событиям, условиям или обстоятельствам) предназначены для обозначения прогнозных заявлений. Эти заявления включают в себя те, которые касаются сроков клинических испытаний Calithera, обзора, регистрации и утверждения CB-668 FDA, а также безопасности и эффективности CB-668. Поскольку такие заявления подвержены рискам и неопределенностям, фактические результаты могут существенно отличаться от тех, которые выражены или подразумеваются в таких прогнозных заявлениях.Потенциальные кандидаты на продукты, которые разрабатывает Calithera, могут не пройти клиническую разработку, получить необходимые разрешения регулирующих органов в ожидаемые сроки или вообще. Кроме того, клинические испытания не могут подтвердить безопасность, эффективность или другие характеристики продукта, описанные или предполагаемые в этом пресс-релизе. Такие продукты-кандидаты могут не принести пользу пациентам или успешно коммерциализироваться. Несоблюдение ожиданий в отношении любого из вышеперечисленных вопросов может отрицательно сказаться на цене акций Calithera.Дополнительную информацию об этих и других факторах риска, влияющих на бизнес Calithera, можно найти в периодической документации Calithera в Комиссию по ценным бумагам и биржам на сайте www.sec.gov. Эти прогнозные заявления не являются гарантиями будущих результатов и действительны только на дату настоящего документа, и, за исключением случаев, предусмотренных законом, Calithera отказывается от каких-либо обязательств по обновлению этих прогнозных заявлений для отражения будущих событий или обстоятельств.

ИСТОЧНИК : Calithera Biosciences, Inc.

КОНТАКТЫ S :
Связи с инвесторами Дженнифер МакНили
Calithera
[email protected]
650-870-1071

СМИ Мишель Паризи
Сэм Браун, Inc.